山牵牛炭疽病病原分离与鉴定△

宋利沙，蒋妮*

(1.广西壮族自治区药用植物园，广西 南宁 530023)

山牵牛Thunbergiagrandiflora(Rottl.ex Willd.)Roxb.，别名大花山牵牛、大花老鸭嘴、大青和老鸭杓，是爵床科Acnthaceae山牵牛属藤本植物[1]。山牵牛在广西、广东、海南和福建鼓浪屿均有种植。山牵牛是瑶医药用植物之一，主要用于消肿拔毒，排脓生肌，止痛。根皮用于跌打损伤和骨折。茎叶蛇咬伤，疮疖，叶用于治疗胃痛[2-3]。目前，对山牵牛主要做为观赏藤本植物[4]，对其药理活性和病害研究尚未见报道。作者在广西药用2017年在广西南宁市广西药用植物园瑶药区调查发现一种严重影响山牵牛生长的病害，该病害主要为害山牵牛叶片，严重时造成叶片枯死。镜检发病组织上的病原孢子，初步将病原菌判断为炭疽菌属Colletotrichumsp.真菌，为进一步明确该病原菌的分类地位，本研究对病原菌进行了分离，并通过形态学和分子生物学相结合的方法进行鉴定，为该病害的有效防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

山牵牛病株于2017年3月采自广西壮族自治区南宁市兴宁区广西药用植物园瑶药区。

1.2 病原菌分离和纯化

选取山牵牛叶片的病健交界处病组织，切成 5 mm×5 mm小块，用75%乙醇浸泡30S，0.1%升汞消毒l min，再用无菌水漂洗 3次，置于PDA培养基上 28 ℃培养，待长出菌丝后，挑取菌落边缘进行纯化，纯化后的菌落通过单孢分离获得纯培养分离物[5]。

1.3 病原菌的致病性测定

用针刺法将分离和纯化的菌丝块(1 cm×1 cm)接种于无病健康且长势相近的山牵牛叶部[5]，以接种无菌PDA培养基(1 cm×1 cm)作为对照，每个处理3个重复，放置于具有湿润的滤纸片的培养皿中，保湿培养，定期观察发病情况。适时对发病组织进行病原菌分离和纯化，观察该病原菌是否与接种菌株相同。

1.4 病原菌形态鉴定

观察病原菌在PDA培养基上的菌落特征，用光学显微镜观察菌丝、分生孢子等形态特征，对病原菌进行形态鉴定。

1.5 分子生物学鉴定

将纯化好的拮抗菌株移植于PDA平板培养基上，培养3 d，然后接种到40 mL PDA培养液的三角瓶(100 mL)中，于28 ℃、180 r·min-1，恒温振荡培养48 h后制成菌体悬浮液，离心收集菌体，采用改良的SDS裂解法用DNA提取试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)提取真菌基因组DNA。ITS扩增引物序列为通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCT TATTGATATGC-3′)。扩增反应在25 μL反应体系中进行，Template(基因组DNA 20～50 ng·μL-1)为0.5 μL，10×Buffer(with Mg2+)为2.5 μL，dNTP(各2.5 mM)为1 μL，酶0.2 μL，引物各0.5 μL，加双蒸H2O至25 μL。热循环反应程序设置如下：94 ℃下初始变性4 min，接下来为94 ℃下变性45 sec，55 ℃下引物退火45 sec，72 ℃下延伸 60 sec，30个循环结束后在72 ℃下修复延伸10 min。扩增中利用水代替DNA模板为空白对照。用凝胶电泳法检测PCR反应结果，吸取4 μL PCR产物加入1%(W/V)琼脂糖凝胶，凝胶置于1×TBE缓冲液(0.9 M Tris-Borate，0.01 M EDTA，pH=8.3)中，在110 V下电泳40 min。将扩增后的 DNA 产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行纯化测序。并且把测序结果与GenBank中的序列进行blast比对。以ITS相似序列，利用MEGA4.0软件的Neighbor-Joining法构建系统发育树。

2 结果分析

2.1 病害症状

该病主要危害山牵牛叶片。叶片发病后，病斑在叶尖、叶缘、叶中部近圆形或不规则形状发展。病斑发病初期，出现黑色小斑点，随后扩大成多边形黑褐色病斑，病斑周围有黄色晕圈，后期病斑穿孔，病斑较多时融合成片，病叶后期叶片黄化枯死(图1)。该病害在山牵牛生长期均可发生，且种种植密度大、排水不良的地块发病较重；高温气候，多雨季节，发生严重，蔓延迅速。

图1 山牵牛叶部危害症状

2.2 病原菌分离和致病性测定

对山牵牛叶片病斑进行病原分离，分离纯化得到形态特征不同的真菌菌株4株。用针刺法将这些菌株接种在离体健康山牵牛叶片上，只有sb10菌落致病。接种后5 d叶片开始发病，7 d后接种部位变黑褐色病斑，病斑周围暗黄褐色。对照叶片组织未发病。从发病的病斑上再次分离到与接种菌株形态一致的病原菌。

图2 山牵牛炭疽病离体接种症状

2.3 病原菌的形态鉴定

病原菌sb10在PDA平板上，28 ℃培养5～7 d，菌落圆形，边缘整齐，菌落从中央变为深灰黑色，菌落背面是深灰色同心轮纹，培养6 d后，菌落中央产生红色球形的分生孢子团。该病菌的菌丝有隔，粗度为2～4 μm，分生孢子盘圆形或椭圆形，黑褐色，直径112～248 μm；刚毛散生于分生孢子盘上，深褐色；分生孢子单胞，无色，长椭圆形，两头钝圆或一端稍尖，大小(11～21)μm×(4～6)μm。

参照《真菌鉴定手册》[7]和《植物病原真菌学》[8]，将该病原菌鉴定为半知菌类腔孢纲黑盘孢目炭疽菌属胶孢炭疽菌C.gloeosporioides。

注：a.菌落；b.分生孢子盘；c.分生孢子。图3 山牵牛炭疽病病原形态

2.4 病原菌的分子(ITS)鉴定

利用真菌 ITS 通用引物 ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)对病原真菌的 rDNA内转录区进行扩增，获得片段大小约为 563 bp 的扩增产物。将扩增后得到的产物在 GenBank 中进行 BLAST比对，结果显示，与山牵牛病病原菌的 ITS 序列相似度在 99% 以上的菌株为胶孢炭疽菌C.gloeosporioides，并与其相似高的菌株构建系统发育树(图4)，综合菌株sb10形态学和分子生物学鉴定该病原菌为胶孢炭疽菌C.gloeosporioides。

图4 基于ITS序列构建sb10菌株系统发育树。

3 结论和讨论

山牵牛可作中药材使用，也可作为观赏的藤本植物，其栽培和开发利用有很大的广阔前景。作者在广西药用植物园种植区发现较严重的炭疽病，并利用形态学和分子手段将该病原鉴定为胶孢炭疽菌C.gloeosporioides。该炭疽菌可危害地榆、田七、猫豆、阔叶十大功劳等多种植物[9-12]，是世界上分布最广的病原菌，但此病原危害山牵牛的叶片为国内第一次报道。此外，胶孢炭疽菌在致病性、寄主特异性和遗传同质性等方面可形成许多亚组和形态种[9]。本研究所获得菌株的寄主范围和专化型确定有待进一步研究确定。该病原菌的生物特性、侵染循环、发病条件、防治技术、药理活性等需要进一步研究加以明确。

目前，山牵牛炭疽病可参考由胶孢炭疽菌引起的其他作物炭疽病的防治技术进行控制，如选用无病种子或进行种子消毒、及时清除病残体、合理密植、创造良好的通风透光条件、合理施肥用水等，或在发病初期使用25%咪鲜胺乳1500倍液喷雾。具体药剂种类及综合防治技术尚待室内筛选试验和田间实践验证。