吉林省北五味子种子种苗带菌检验初步研究

崔丽丽，闫梅霞，冯志伟，金银萍，许陪磊，王英平※

（1.中国农业科学院特产研究所，长春 130112；2.抚松县参王植保有限责任公司，吉林 抚松 134504）

种子的质量由种子的纯度、活力、健康状况等因素决定。种子品质是提高作物产量和质量的重要物质基础。种传病原菌可以导致种子不育、种子萎缩变小、变色、腐烂坏死和萌发力降低[1]。为保证种子质量，对种子进行健康检验尤为重要。五味子〔Schisandra chinensis(Turcz.)Baill〕为木兰科多年生落叶木质藤本药用植物，以果实入药。五味子属（SchisandraMichx）全世界约有50种，主要分布在东亚地区，在我国约有20种，分布于西南、华南至东北地区。产于东北三省及内蒙古的习称北五味子（又称辽五味子），产于南方的习称南五味子，产于西北地区的习称西五味子[2]。五味子药、食兼用，具有较高的药用和经济价值。五味子在中医临床中应用广泛，用于久嗽虚喘、梦遗滑精、遗尿尿频、久泻不止、自汗、盗汗、津伤口渴、短气脉虚、内热消渴、心悸失眠等症。目前，国内已有报道的五味子真菌病害种类为黑斑病〔鹅掌揪链格孢（Alternaria liriodendri T.Y Zhang et J.Z.Zhang）〕[3,4]、根腐病〔尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）〕[3]、茎基腐病〔木贼镰刀菌（F.equiseti）、茄腐镰刀菌（F.solani）、尖孢镰刀菌（F.oxysporum）、半裸镰刀菌（F.semitectum）〕[5]、叶枯病［细极链格孢〔A.tenuissima（Fr.）Wiltshire〕］[6,7]、褐斑病［球状茎点霉〔Phoma glomerata（corad）Wollena ex Hoehapf〕］[8]、白粉病〔五味子叉丝壳菌（Microsphaera schizandrae）〕[9,10]、立枯病（Rhizoctonia solani）[11]、锈病〔五味子春孢锈菌（Aecidiumschisandrae）〕[12]。北五味子是长白山地区特色的植物资源，近年来，人工栽培面积在不断增加，五味子病虫害也呈现出上升趋势，病虫害防治是北五味子栽培的重要技术环节[13]。目前，有辽宁省北五味子种子、种苗带菌检测研究的报道[14,15]。本试验以吉林省北五味子种子、种苗为对象进行健康检测，为种子、种苗标准制定提供理论依据，同时为病害防治奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

2015年10月初分别收集于吉林省抚松县和吉林省昌邑区左家镇。种子样品8份（吉林省抚松县5份，吉林省昌邑区左家镇3份），每份约200粒～300粒；种苗样品10份（抚松县5份，左家镇5份），每份20株～30株。

1.2 供试材料处理

1.2.1 种子处理 每1份样品随机选取100粒种子，在无菌操作台中，50粒种子 3%NaClO无菌消毒3min～4min，无菌水冲洗3次；另外50粒种子3%NaClO消毒4min，无菌水冲洗3次，分开种壳和种仁，晾干待用。外部带菌检测随机取样50粒～100粒种子，无处理，待测。

1.2.2 种苗处理 取1cm～2cm长茎，3%NaClO消毒3min～4min，无菌水冲洗3次，用无菌手术刀平分为5段，每份样品处理10株，晾干待用。

1.3 检测方法

1.3.1 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）平板法 种子内部带菌检测：培养皿（直径9cm）中倒入10mL已灭菌 PDA制成平板。种子检测时将已处理好的10个整粒种子、10个种壳、10个种仁分别放入3个培养皿中；种苗检测时每个培养皿中均匀地放入已处理好的5段茎，1株种苗1个培养皿，25℃、光照和黑暗各12 h交替培养（培养皿应在灯下约25cm处，不堆叠放置）7d～10d。实验设置不放种子的空白对照，3次重复。

种子外部带菌检测：不消毒直接培养，每个培养皿中放置方法和数量与内部带菌检测一致。

肉眼观察菌落形态，立体显微镜20×观察真菌生长情况，100×观察辨认分生孢子，记录每平板中感染种子数，同时挑取单个菌落进行PDA分离纯化培养，获得纯菌株后PDA试管保存。

1.3.2 纸培养法 每个培养皿中放入2张灭菌滤纸，加入无菌水约10mL备用。检测方法同PDA平板法。

1.4 真菌鉴定

PDA平板法和纸培养法培养时将分离到的真菌分别进行纯化、镜检和转管保存。根据培养性状和形态特征，参照《真菌鉴定手册》[16]进行鉴定。

2 结果与分析

2.1 种子带菌检测结果

2.1.1 种子外部带菌结果 种子外部带菌率 PDA培养法（32.11%～46.07%）稍高于纸培养法（22.47%～45.38%），种子外部携带的优势菌群主要为青霉属（Penicillium spp.）、曲霉属（Aspergillus spp.）、根霉属（Rhizopus sp.），分离频率分别为43.90%～75.07%、2.44%～21.2%、2.44%～10.15%。此外，还有镰刀菌属（Fusariumspp.）、链格孢属（Alternaria spp.）、木霉属（Trichoderma sp.）和毛霉属（Mucorsp.）。对比不同地区，抚松县种子外部带菌率比左家镇低13%左右。见表1。

2.2 北五味子种苗带菌检测结果

表1 北五味子种子外部分离真菌及分离频率Table 1 Genera and proportions of fungi isolated from S.chinensis seed suface

2.1.2 种子内部带菌结果 种子内部分离频率最高的是青霉属，分离频率为25.00%～71.42%。检验方法不同，实验结果有差异。与纸培养法相比，PDA法检测出的真菌种类多，共检出青霉属、镰刀菌属、链格孢属、木霉属、葡萄孢属（Botrytisspp.）、毛霉属和曲霉属8种，纸培养法没有检测到葡萄孢属和毛霉属。

种子内部带菌率在地区间有差异，整粒种子、种壳和种仁的带菌率抚松县均较高，整粒种子为11.15%～12.50%、种 壳 为 9.38%～9.56%、种 仁 为8.16%～15.00%；左家镇样品整粒种子为7.87%～9.09%、种壳为6.09%～9.38%、种仁为6.56%～7.30%。

表2 北五味子种子内部真菌及分离频率Table 2 Genera and frequenceies of fungi isolated from inside seed

采用 PDA平板法检测的种苗带菌率为53.33%～76.11%，明显高于纸培养法（13.67%～20.19%），检出真菌主要有链格孢属（带菌率37.28%～60.22%）、镰刀菌属（带菌率7.12%～22.35%）、木霉属（带菌率3.76%～14.24%），其次，还有毛壳菌属（Chaetomium spp.）、柱孢属（Cylindrocarpom spp.）、弯孢属（Curvularia spp.）、曲霉属、青霉属。PDA平板法检测出了纸培养法没有检出的弯孢属。结果见表3。

3 结论与讨论

表3 北五味子种苗真菌及分离频率Table 3 Genera and frequenceies of fungi isolated from inside seedling

3.1 对来自抚松县、左家镇的8份北五味子种子进行带菌检测，实验结果表明，北五味子种子外部带菌率为22.47%～46.07%，明显高于内部带菌率（4.69%～12.50%），但是种子内部携带真菌种类多。

3.2 对来自抚松县和左家镇两个地区10份种苗资源进行带菌检测，种苗带菌率明显高于种子带菌率，其中，链格孢属分离频率最高，其次是镰刀菌属。

3.3 五味子种苗携带柱孢属真菌为首次报道，但尚未有柱孢属真菌引起五味子病害的报道。柱孢属真菌是一种常见的土壤习居菌，地理分布较广，英国、美国、法国、中国、日本、韩国等很多国家均有柱孢属真菌报道，柱孢属真菌寄主范围也很广，分别隶属于61科108属，果苗、花卉及以根入药的植物上其危害较大[17]。中国人参锈腐病4类致病锈腐菌为柱孢属真菌，年平均发病率在20%～30%左右，在主要参区则高达70%～80%，严重影响了人参的质量和产量。K.A.Seifert等[18]用微管蛋白基因和rRNA基因内转录间隔区（ITS）序列方法测定北美西洋参根腐病菌株确定为Cylindrocarpon destructans。Traquair等[19]报道，C.destructans导致果蔬储藏期的发霉和果树冷藏期的腐烂，可见，柱孢属真菌的危害很大。本试验分离到柱孢属菌株，还需要对其进行生物学特性和致病性等相关其他研究。

3.4 不同检验方法对实验结果有影响，与纸培养法相比，PDA法检测出的真菌种类多，更能反映出真实的种子、种苗带菌情况。本实验仅对吉林省2个产地北五味子种子、种苗携带的真菌种类及带菌率进行了初步研究，而关于五味子种子、种苗健康检验工作还需要进一步开展。