二乙烯亚胺对水貂肠炎细小病毒灭活效果的研究

罗国良，王振军，冯二凯，易立，郭利，叶明，张淼，程悦宁※

（1.中国农业科学院特产研究所，长春 130112；2.吉林特研生物技术有限责任公司，长春 130122）

水貂病毒性肠炎又称水貂细小病毒性肠炎，是由水貂肠炎细小病毒（Mink enteritis virus，MEV）引起的以剧烈腹泻为主要临床特征的急性、烈性和高度接触性传染病。在自然条件下，不同品种和不同年龄的水貂均有感染性，但幼貂的感染性极强。水貂病毒性肠炎没有特异性的治疗药物，疫苗接种是控制该病流行的有效手段。

目前，用于水貂肠炎细小病毒免疫预防的常规疫苗主要有灭活疫苗和弱毒疫苗。灭活疫苗常用的传统灭活剂为甲醛，甲醛灭活工艺虽能取得较好的灭活效果，但甲醛易破坏病毒的免疫原性，且其残留易引起机体应激反应。二乙烯亚胺是烷化剂的一种，作为另一类良好的病毒灭活剂，仅破坏病毒的核酸，而不影响蛋白成分结构，能最大程度保持病毒的抗原性[1]，近年来已应用于猪细小病毒[2]、猫杯状病毒[3]、伪狂犬病毒[4]、口蹄疫病毒[5]等多种病毒的灭活，并取得良好的免疫效果。本试验通过使用不同终浓度的二乙烯亚胺（Binary ethylenimine，BEI）对 MEV 进行不同时间的灭活，确定BEI灭活参数，并对BEI灭活和甲醛灭活的水貂肠炎细小病毒灭活疫苗进行了免疫效果对比。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒与细胞 水貂肠炎细小病毒MEVB株（中国农业科学院特产研究所保存）；F81细胞（中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库提供）。

1.1.2 主要试剂 MEM培养基、0.25%胰酶-EDTA消化液（Corning公司），2-溴乙胺氢溴酸盐（BEA）（Sigma-Aldrich公司），甲醛（国药集团），其它试剂为国产分析纯。

1.1.3 实验动物 水貂，购自农业部长白山野生生物资源重点野外科学观测试验站。

1.2 方法

1.2.1 BEI的配制 用0.2N NaOH溶液配制0.1mol/L的BEA溶液，在37℃下作用，其间每隔10min～15min振摇1次，作用60min即成0.1mol/L的BEI溶液，然后0.22µm滤器过滤除菌。

1.2.2 MEVB灭活试验 随机取MEVB病毒液5瓶，500mL/瓶，4瓶病毒液按终浓度为 0.003mol/L、0.002mol/L、0.001mol/L、0.000 5mol/L分别加入BEI溶液，另1瓶病毒液按终浓度为0.15%加入甲醛溶液。以上5瓶病毒液与灭活剂充分混匀，于30℃灭活，分别于24h、48h、72h取样进行灭活检验，用BEI灭活的病毒液于72h取完样后加入 BEI使用量的10%的1mol/L硫代硫酸钠中和BEI。

1.2.3 灭活检验 取灭活病毒液，用无血清 MEM 1∶5稀释后分别同步接种F81细胞4瓶，每瓶0.5mL，置37℃下培养，24h后换维持液，继续培养3日后再传1代，观察有无细胞病变，收获培养液进行血凝试验，检测其对猪红细胞的血凝价。

1.2.4 灭活疫苗的制备 取经灭活检验合格的病毒液（BEI灭活浓度为0.002mol/L、灭活时间24h），按病毒液∶氢氧化铝胶＝9∶1的比例制成水貂肠炎细小病毒灭活疫苗，按现行《中国兽药典》附录进行性状和无菌检验。

1.2.5 灭活疫苗安全试验 取制备的疫苗肌肉注射健康易感水貂〔水貂肠炎细小病毒血凝抑制抗体（HI）≤1∶4〕5只，每只水貂 5mL，分4点注射，观察10d，观测精神、食欲、体温、粪便与接种部有无异常反应。

1.2.6 灭活疫苗效力试验 用2月龄～10月龄健康易感水貂 5只（水貂肠炎细小病毒 HI抗体效价≤1∶4），分别肌肉接种BEI疫苗1mL；另设甲醛灭活疫苗组水貂5只，肌肉接种1mL/只，作为平行对照，21d后，连同阴性对照水貂5只，分别采血，测定HI抗体效价。

2 结果

2.1 不同浓度BEI灭活效果

BEI灭活浓度＞0.002mol/L时，灭活24h以后的样品均未出现CPE，传代后未出现CPE，亦没有检测出血凝价。BEI灭活浓度为0.001mol/L时，灭活24h可检出CPE，传代后亦出现CPE，且均检测出血凝价；灭活48h以上时，样品均未出CPE，传代后未出现CPE，亦没有检测出血凝价。BEI灭活浓度为0.000 5mol/L时，灭活时间为24h和48h时均可检出CPE，传代后亦出现CPE，且均检测出血凝价。为了确保疫苗制备过程的灭活效果，同时提高制备效率，确定水貂肠炎细小病毒的灭活条件为BEI终浓度为0.002mol/L、灭活时间24h、灭活温度30℃，灭活完毕加入BEI使用量10%的1mol/L硫代硫酸钠中和BEI。结果见表1。

2.2 疫苗的制备结果

制备的疫苗呈粉红色均匀混悬液，静置后，上层为粉红色澄清液体，下层为淡粉红色沉淀，摇匀后呈均匀混悬液。经无菌检验，符合规定。

表1 BEI灭活MEVB试验灭活检验结果Table 1 The inactivation effect of binary ethylenimine on mink enteritis virus

2.3 疫苗安全试验结果

制备的疫苗接种水貂，观察10d，水貂5/5均健活，未发现任何体温、精神、食欲与粪便异常，亦未发现局部异常反应。

2.4 疫苗效力试验结果

表2 BEI与甲醛灭活MEVB制备疫苗免疫效果对比Table 2 Comparison of immune efficacy of BEI-inactivated and formaldehyde-inactivated MEV vaccine

从疫苗效力试验结果来看，BEI灭活疫苗和甲醛灭活疫苗均达到效苗保护抗体（HI=1∶32）水平之上，BEI灭活疫苗较甲醛灭活疫苗免疫后平均抗体水平高，但经统计比较，差异不显著（P＞0.05)。

3 讨论

甲醛作为疫苗灭活剂目前仍被广泛应用，主要通过对病毒蛋白羧基端发生作用，从而使病毒失活，虽有灭活病毒快速、彻底等优点，但它属于致癌物，可能会给动物造成潜在的应激风险。甲醛的灭活过程会使部分病毒蛋白结构破坏，从而可能会降低疫苗的免疫原性。BEI属氮丙啶（Aziridine）类化合物，是由2-溴乙胺氢溴酸盐（2-Aminoethyl bromide hydrobromide，BEA）在碱性环境下环化而成。BEI作为核酸灭活剂，通过干扰核酸代谢，破坏病毒核酸达到灭活病毒的目的，而不影响其蛋白质成分。本试验采用BEI对水貂肠炎细小病毒进行灭活试验，旨在找到一种安全、有效的替代甲醛的灭活水貂肠炎细小病毒的灭活剂。试验结果表明，BEI在一定浓度下，能有效灭活水貂肠炎细小病毒，随着BEI的浓度升高，灭活能力越强，所需的灭活时间越短；BEI终浓度为0.002mol/L、灭活时间24h是水貂肠炎细小病毒适宜的灭活参数；使用该参数制备的疫苗进行了安全和免疫效力试验，安全试验结果表明，BEI灭活的疫苗对水貂安全；从效力试验的结果可以看出，BEI灭活的疫苗较甲醛灭活疫苗HI抗体水平略高，这可能与BEI灭活时不影响蛋白成分，最大程度保留了病毒的免疫原性有关。本试验的结果证明，BEI灭活制备的水貂肠炎细小病毒疫苗对水貂安全，免疫效果良好，其诱导产生抗体的能力优于传统的甲醛灭活疫苗。