LPXTG基序蛋白lmo0159基因缺失株的构建及对单增李斯特菌环境适应能力的影响

张奇文，凌晨，杜冬冬，钱凌霄，李红欢，薄新文，马勋

（1石河子大学动物科技学院，新疆 石河子 832003；2省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室/新疆农垦科学院,新疆 石河子832003）

单增李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)是一种能引起人和动物发病的重要食源性人畜共患病病原菌，广泛存在于自然界，如河水、污泥、食品、屠宰场弃物、动物、青贮料、土壤等[1]，其具有较强的环境适应性，可在低温、高盐、酸碱等不利的环境条件下生长繁殖[2]。LM可穿越宿主肠道屏障、胎盘屏障、血脑屏障，入侵宿主机体后在吞噬细胞和非吞噬细胞内存活并大量增殖[3]。引起肠胃炎、脑膜炎、败血症、流产等症状，尤其是对新生儿、妊娠母畜和免疫功能不全者，其发病率和死亡率均较高[4]。该菌是世界卫生组织 (World Health Organization，WHO)列为仅次于大肠杆菌O157、沙门氏菌、志贺氏菌后的第四大重要的食源性致病菌[5]，成为许多国家食品卫生的必检项目之一。

LM有一类表面蛋白，其前体蛋白C端含有保守基序 LPXTG(Leu-Pro-X-Thr-Gly)，这些蛋白由分选酶Sort A通过识别LPXTG保守基序，将蛋白共价结合到细胞壁肽聚糖上，呈现在细胞表面，在感染机体过程中发挥重要毒力作用[6]。蛋白组学分析发现[7]，标准菌株含有41个LPXTG保守基序蛋白，但目前仅有部分蛋白的功能被研究，如：InlA蛋白可通过N末端的LRR区和其后连接的IR区介导LM粘附肠道上皮，通过表面特异性受体E-钙粘素介导 LM侵入机体[8]；Kirchner等[9]研究发现，LM可通过 InlF蛋白介导作用抑制宿主细胞中的ROCK激酶的活性，进而增强LM对细胞的粘附与侵袭能力；Christophe等[10]利用基因缺失的方法研究inlJ基因功能时发现，LM缺失inlJ基因后毒力大幅降低；Lmo2085蛋白可使LM在胞内具有运动能力，促进细胞间进行信息传递和躲避机体的免疫应答[11]；Lap B蛋白具有黏附功能，可通过其N端结构域与宿主细胞受体相互作用，Sievers等[12]进一步验证了LM缺失lap B基因后其毒力减弱。

目前，对LPXTG基序蛋白Lmo0159蛋白的研究主要针对其分子结构特征方面，而对该蛋白在参与调控LM毒力及环境应激方面发挥的具体作用并未见相关报道。因此，本研究拟利用SOE-PCR及同源重组技术构建 LM90SB2-Δlmo0159缺失株，并对野生株和lmo0159基因缺失株在不同胁迫环境的适应能力进行了研究，以期为进一步了解LM环境耐受性及其致病性奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒

LM90SB2是新疆致绵羊脑炎单增李斯特菌分离株，由石河子大学动物科技学院实验室分离、鉴定并保存，血清型为4b型；穿梭载体pKSV7由浙江大学动物科学学院分子微生物与食品安全卫生实验室保存惠赠；pMD19-T(Simple)载体购自大连宝生物(Takara)公司；大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α购自北京全式金生物技术有限公司。

1.1.2 主要试剂

质粒小提取试剂盒、细菌基因组DNA提取试剂盒均购自天根生化科技有限公司(北京)；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自北京诺维森生物科技有限公司；DNA Marker、Pfu DNA 高保真聚合酶、dNTPs均购自北京全式金生物技术有限公司；2×PCR Mix购自上海东盛公司；限制性内切酶BamHⅠ、PstⅠ、T4 DNA连接酶均购自Promega生物技术有限公司(上海)；氨苄青霉素、氯霉素购自美国Sigma公司；BHI培养基购自海博生物技术有限公司(青岛)，胰蛋白胨，酵母粉等购自北京陆桥技术股份有限公司。

1.1.3 主要仪器

SG403TX型生物安全柜，美国Baker公司；HITACHI型CR22E高速冷冻离心机，日本日立公司；GH600BC型隔水式电热恒温培养箱，北京永光明医疗仪器厂；ArKtiK型PCR扩增仪，美国Thermo公司；GEIDOCXR型电泳凝胶成像仪和165-2089型电转化杯，美国Bio-Rad公司；Electroporator2510型电转仪，德国EPPENDORF公司；PH211C型精密数显酸度计，意大利哈纳公司；POWER WAVE XS型全自动酶标仪，美国BIOTEK公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成

参照 GenBank中公布的F2365菌株 (登录号：AE017262)和EGD-e菌株的lmo0159基因序列(登录号：AL591824)，应用 Primer5.0软件设计用于扩增lmo0159基因上下游同源臂片段、验证缺失株以及LM的特异性引物，在lmo0159-F1和lmo0159-R2 5’端分别引入BamHⅠ和PstⅠ (斜体下划线部分)和保护性碱基(斜体部分)(表1)，由上海生工有限公司合成。

表1 构建LM90SB2 lmo0159基因缺失株特异性引物Tab.1 Specific primers for construction of lmo0159 gene deletion strain of LM90SB2

1.2.2 lmo0159基因上、下游臂片段的扩增

以细菌DNA提取试剂盒提取的LM90SB2 DNA为模板，用Pfu DNA高保真聚合酶及lmo0159-F1和lmo0159-R1扩增上游臂片段，lmo0159-F2和lmo0159-R2扩增下游臂片段；25 μL反应体系：10×PCR Buffer 2.5 μL，Pfu DNA 高保真聚合酶 1 μL，dNTPs 1 μL，DNA 模板 2 μL，上下游引物各 1 μL，ddH2O 16.5 μL。反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60.7 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶后，DNA回收试剂盒回收。

1.2.3 lmo0159基因同源臂融合、克隆及测序

以上述获得的上下游同源臂为模板进行第一步融合后，再以lmo0159-F1和lmo0159-R2引物通过SOE-PCR方法进行第二步融合，获得lmo0159基因缺失盒Δlmo0159。具体步骤如下：第一步融合，采用20 μL 反应体系：10×PCR Buffer 2 μL，dNTPs 2.5 μL，上下游同源臂各 3 μL，Tap DNA聚合酶 0.5 μL，ddH2O 9 μL。反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，15个循环；72 ℃ 10 min。第二步融合，再加入lmo0159-F1和lmo0159-R2引物各0.5 μL扩增片段全长，反应条件：95℃ 5 min；95 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30 个循环；72℃ 10 min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收后，与pMD19-T(Simple)载体连接，冷热激法转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，通过菌液PCR筛选出阳性克隆菌，提取质粒进行酶切验证成功后，送北京六合华大基因科技有限公司测序，将测序正确重组质粒命名为pMD19-T-Δlmo0159。

1.2.4 pKSV7-Δmo0159重组穿梭质粒的构建

分别将pMD19-T-?lmo0159和pKSV7穿梭质粒用BamHⅠ和PstⅠ置于37℃水浴中双酶切，酶切3 h后，加入4 μL 10×Loading buffer终止酶切反应，经凝胶电泳验证正确后切胶回收目的条带，利用T4 DNA连接酶将酶切后的Δlmo0159片段连入pKSV7载体；然后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经菌液PCR(lmo0159-F1和lmo0159-R2)和双酶切验证成功后，送北京六合华大基因科技有限公司测序。

1.2.5 电转后阳性转化子筛选

参照文献[13]制备单增李斯特菌LM90SB2感受态细胞。取10 μL pKSV7-Δlmo0159重组穿梭质粒加入100μL LM90SB2感受态细胞中，并使之混匀后加到处理好的电转杯中，冰浴10 min，电转化(2.5 kV，5 ms)，加入 1 mL BHI(含 0.5 M 蔗糖)液体培养基，冰浴30 min后转置30℃恒温培养箱静置3 h，8 000 r/min离心5 min，弃上清，剩余菌体涂布于BHI琼脂平板 (含10 μg/mL氯霉素)，30 ℃培养 48 h，挑取单菌落置30℃过夜培养，通过菌液PCR(lmo0159-F1和lmo0159-R2)筛选出阳性转化子。

1.2.6 同源重组及遗传稳定性鉴定

将上述鉴定的阳性转化子接种于BHI液体培养基，在温度(42℃)和氯霉素抗性(10 μg/mL)的双重压力下进行同源重组。传代培养25代后，挑单菌落，菌液PCR筛选出有氯霉素抗性的单交换重组菌。然后再在无氯霉素抗性BHI液体培养基中在30℃培养以丢失抗性质粒，通过影印接种于抗氯霉素和不抗氯霉素BHI板筛选出无抗性的缺失株，再经验证引物（lmo0159-A和lmo0159-B）和LM特异性引物（Hly-F和Hly-R）PCR进一步鉴定。最终得到鉴定正确基因缺失株 LM90SB2-Δlmo0159。将获得的重组缺失菌株在无抗性37℃传代培养25代，每间隔5代进行菌液 PCR鉴定 LM90SB2-Δlmo0159的遗传稳定性。

1.2.7 lmo0159基因缺失株对不同胁迫环境试验

分别挑取LM90SB2和LM90SB2-Δlmo0159单菌接种于BHI液体培养基中，37℃培养至OD600nm≈0.4，以1∶100的比例分别接种于15 mL BHI液体培养基中，分别置于4、37和42℃恒温细菌振荡培养箱 (180 r/min)培养；以1∶100的比例分别接种于NaCl浓度为2.5%和4.5%，乙醇浓度为3.5%的15 mL BHI液体培养基中，37℃恒温细菌振荡培养箱(180 r/min)培养，每间隔1.5或2 h，置全自动酶标仪中测定OD600nm值，绘制生长曲线，观察并分析lmo0159基因缺失后对LM90SB2在不同环境胁迫下生长能力的影响。

2 结果与分析

2.1 lmo0159基因缺失片段的融合

本研究以lmo0159-F1和 lmo0159-R1、lmo0159-F2和lmo0159-R2为引物分别扩增上、下游同源臂，经琼脂糖凝胶电泳分别得到388和409 bp单一目的条带，与预期结果相符(图1)。

SOE-PCR融合上、下游同源臂，用10 g/L琼脂糖凝胶电泳得到长为797 bp片段，与预期结果一致(图2)。经测序、序列比对分析表明已成功缺失lmo0159基因序列。

图1 lmo0159基因上下游同源臂PCR扩增结果Fig.1 Homologous arms amplified of lmo0159 gene by PCR

图2 lmo0159 SOE-PCR扩增结果Fig.2 Products amplification of lmo0159 by SOE-PCR

2.2 重组穿梭质粒 pKSV7-Δlmo0159的构建及鉴定

图3 pMD19-T-lmo0159双酶切鉴定Fig.3 Identification of pMD19-T-lmo0159 by double enzyme digestion

Δlmo0159与pMD19-T(Simple)载体连接后，转化至大肠杆菌DH5α中，经PCR鉴定为阳性的菌液提取质粒pMD19-T-Δlmo015经双酶切鉴定得到了2692和797 bp条带(图3)，测序结果经序列分析比对后，与预期结果一致。将同步双酶切胶回收后的Δlmo0159片段与pKSV7载体连接，转化至大肠杆菌DH5α中，将PCR筛选出阳性菌液，提取质粒pKSV7-Δlmo0159双酶切鉴定得到6900和797 bp条带(图4)，结果均符合预期片段大小，表明重组穿梭质粒pKSV7-Δlmo0159成功构建。

2.3 LM90SB2-Δlmo0159缺失株的筛选与鉴定

图4 pKSV7-lmo0159双酶切鉴定Fig.4 Identification of pKSV7-lmo0159 by double enzyme digestion

电转后，以lmo0159-A和lmo0159-B为引物筛选出的阳性转化子可扩增得到2932和962 bp目的条带 (图5A)；42℃和氯霉素抗性的双重压力下传代培养25代，PCR筛选得到只有1条962 bp的目的条带，且含氯霉素抗性的单交换重组菌；30℃和无氯霉素抗性的条件下传代培养25代，可获得无氯霉素抗性和不含lmo0159基因(只含有1条962 bp条带)的细菌，即表明成功构建了LM90SB2-Δlmo0159缺失株(图5 B)；37℃无抗性传代培养25代，菌液PCR检测显示：Δlmo0159缺失株只能扩增出962 bp单一条带，LM90SB2野生株只能扩增出2932 bp单一条带，结果表明缺失条带稳定存在，得到了稳定遗传的lmo0159基因缺失株(图5C)。

图5 LM90SB2-lmo0159重组菌PCR检测Fig.5 Identification of recombinant bacteria LM90SB2-lmo0159 by PCR

2.4 LM在不同胁迫环境的试验结果

2.4.1 不同温度对LM生长的影响

将LM90SB2和LM90SB2-Δlmo0159分别置于不同温度条件下培养，测定OD600nm值绘制其生长曲线。结果显示：2株菌在4℃生长均极其缓慢，缺失株的生长趋势与野生株相同，表明lmo0159基因的缺失并未对野生株的耐寒特性造成明显影响 (P＞0.05)；在37和42℃培养下生长迅速，均在4 h之后进入对数生长期，但随着时间的推移，缺失株的生长显著低于野生株，差异显著(P＜0.05)，尤其是42℃缺失株的对数生长期维持时间仅约4 h，而野生株长达 6 h。(图 6A-C)。

图6 LM90SB2和LM90SB2-Δlmo0159在不同环境胁迫中的生长曲线Fig.6 Growth curves of LM90SB2 and LM90SB2-Δlmo0159 at different environmental stress

2.4.2 不同NaCl浓度对LM生长的影响

野生株和缺失株在4.5%NaCl的BHI培养基中生长受到明显抑制(图6E)，生长差异不显著(P＞0.05)；但在2.5%NaCl BHI中培养的结果显示，缺失株的生长在进入对数期后显著低于野生株，差异显著(P＜0.05)(图 6D)。

2.4.3 3.5%乙醇浓度对LM生长的影响

在含有3.5%乙醇BHI中，野生株和缺失株的生长均受到明显抑制，但随着时间的推移，缺失株的生长能力较野生株显著下降，差异显著 (P＜0.05)(图 6F)。

3 讨论

LM是重要的人畜共患病病原菌，被 WHO列为重要的食源性致病菌之一[14]，受到许多国家的关注。毒力因子在LM致病过程中起关键作用 (包括内化素、菌体蛋白Act A，李氏杆菌溶血素O，磷酸脂酶C，蛋白Cwh A和金属蛋白酶等)[15]。LM表面存在多种形式并发挥功能作用的蛋白群，根据不同的锚定系统和潜在结构域，将其分为四种，分别为LPXTG表面蛋白、疏水性尾部蛋白、GW蛋白和脂蛋白[16]。随着生物信息学、基因组学、蛋白组学技术的不断深入，LPXTG基序蛋白的功能相继报道。生物信息学分析发现Lmo0159蛋白具有1个胶原蛋白结合位点和3个Cna B结合位点，其二级结构是以无规则卷曲为主的混合型，在氨基酸生物合成、酶代谢、脂肪酸代谢、免疫应答和胁迫应答等方面发挥作用的几率均较高。

本研究利用SOE-PCR及同源重组技术，通过自杀性重组质粒电转化方法，成功构建LM90SB2-Δlmo 0159基因缺失株，为进一步研究lmo0159基因表达产物的功能奠定基础。LM在1-45℃条件下均可生长，其耐寒特性对食物保藏和公众健康造成严重威胁[7]。本研究通过体外培养试验发现，野生株和缺失株在4℃条件下的生长均缓慢且无显著差异 (P＞0.05)，但在42℃条件下2株细菌生长迅速，但缺失株生长速度明显低于野生株(P＜0.05)，且对数生长期缩短，表明lmo0159基因可能参与了LM对高温环境的适应。

高渗溶液使细菌的细胞失水收缩，胞质溶质浓度升高，使细菌细胞生物功能遭到破坏，从而生长繁殖受到抑制。醇类物质可侵入菌体细胞，破坏蛋白质表面的水膜，使之失去活性，同时也破坏细菌蛋白质的肽健，使之变性。有研究报道[17-19]，LM EGDe缺失rli87基因后在3.8%乙醇和10%高渗环境下生长曲线与亲本株无显著差异；而缺失hfq基因后，无论是5%和7%高渗环境，还是3.5%和4.5%乙醇环境，LM-Δhfq的生长均受到显著抑制与亲本株有显著差异。本研究中野生株和缺失株的生长在4.5%高渗环境下均受到抑制，生长缓慢，但差异不显著，但在2.5%高渗和3.5%乙醇环境下，野生株生长正常，而缺失株的生长受到显著抑制，远远低于野生株，差异显著，可见，缺失株对2.5%高渗和3.5%乙醇抵抗能力下降，表明lmo0159基因可能参与了LM对一定高渗环境和乙醇环境的适应。

本试验成功构建了单增李斯特菌LM90SB2-Δlmo 0159缺失株，对缺失株抗胁迫能力研究表明，lmo0159基因对LM抗高温和一定程度的高渗和乙醇具有重要作用。