苦参素对肝癌细胞HepG2增殖及能量代谢的影响

2018-08-29 11:00蒋旗黄赞松苏建伟曹聪
中国医学创新 2018年13期

蒋旗 黄赞松 苏建伟 曹聪

【摘要】 目的:观察苦参素(OM)对人肝癌细胞株HepG2细胞增殖、细胞内ATP含量、上清液乳酸生成速率的影响,探讨其可能的机制。方法:体外培养人肝癌细胞株HepG2,CCK-8法观察不同浓度、不同作用时间的OM对HepG2细胞增殖的影响;高效液相色谱技术、乳酸试剂盒分别检测苦参素作用48 h后细胞内ATP、上清液乳酸乳酸生成速率影响。结果:OM可以抑制人肝癌细胞株HepG2细胞增殖,其作用效果随药物浓度、作用时间增加而增强(P<0.05);不同浓度苦参素作用48 h后细胞内ATP含量、上清液乳酸生成速率显著下降(P<0.05)。结论:OM可以抑制人肝癌细胞株HepG2细胞增殖,呈现时间-剂量依赖性,作用机制可能是抑制细胞有氧糖酵解使细胞内ATP含量下降有关。

【关键词】 肝癌细胞株HepG2; 苦参素; 三磷酸腺苷; 糖酵解

Influence of Oxymatrine on Proliferation and Energy Metabolise of HepG2 Hepatoma Cell/JIANG Qi,HUANG Zansong,SU Jianwei,et al.//Medical Innovation of China,2018,15(13):027-030

【Abstract】 Objective:To observe the effects of oxymatrine(OM) on the proliferation、The level of intracellular ATP and Lactic acid concentration in the culture supernatant of HepG2 hepatoma cell,and to disscuss potential mechanism.Method:HepG2 hepatoma cell was cultured in vitro,CCK-8 method was used to detect the proliferation effect at the different concentrations and different times;a high performance liquid chromatography and enzymatic colorimetric method were used to measure the levels of intracellular ATP and the rate of lactic acid concentration growth in the culture supernatant after treating with 48 h oxymatrine respectively.Result:There was significant difference in inhibited effect of OM on the proliferation of HepG2 hepatoma cell,and with the increase of OM concentration and prolonging the time of action, the inhibition effect of OM on the human hepatoma cell line HepG2 was more obvious(P<0.05).The level of intracellular ATP lower and the rate of Lactic acid concentration growth in the culture supernatant After treating with 48 h OM by the different concentrations(P<0.05).Conclusion:OM can inhibit the proliferation of HepG2 hepatoma cell,and there is time and dose depended.The mechanism of OM anti-hepatoma may be that through targeting of the glycolytic pathway and results in decreased ATP.

【Key words】 HepG2 hepatoma cell; Oxymatrine; Adenosine triphosphate; Glycolysis

First-authors address:Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities,Baise 533000,China

doi:10.3969/j.issn.1674-4985.2018.13.007

有氧糖酵解即“Warburg effect”參与肝癌的发生、发展及转移成为研究的热点,基于肿瘤细胞能量代谢为靶点的药物,有望成为恶性肿瘤临床治疗的新的突破口[1-3]。前期实验研究表明苦参素可能通过上调MicoRNA122[4],从而抑制肝癌HepG2细胞增殖。近来研究发现MircoRNA是关键的代谢调节剂,直接或间接参与癌症的代谢。因此研究苦参素对HepG2细胞能量代谢影响,进一步研究其抗肿瘤作用。目前研究苦参素影响肿瘤细胞能量较少。本实验研究苦参素(Oxymatrine或OM)对HepG2细胞增殖及细胞内ATP含量影响,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 HepG2人肝癌细胞株:购于中科院上海细胞库;DMEM无糖培养基(GFM)、DMEM低糖培养基(GM):购于美国GIBICO;胰酶-EDTA混合液、RPMI-1640培养液:购于北京索莱宝科技有限公司;CCK-8试剂盒:购于碧云天生物科技;苦参素注射液:购于正大天晴药业股份有限公司;三磷酸腺苷(ATP)购于美国Sigma公司,HPLC级;抗霉素-A(AntA)美国Sigma公司。仪器:CO2恒温培养箱MCO-18AIC、戴安U3000型液相色谱仪、雷磁PHS-3C PH计、乳酸测定试剂盒

1.2 方法

1.2.1 CCK-8检测OM作用HepG2细胞增殖的影响 分组:实验组(OM组)、阴性与空白对照组;取细胞悬液高倍细微镜计数细胞密度,将细胞密度为5 000个细胞/mL接种到96孔中,100 μL/孔。恒温培育至细胞贴壁,加入事先配置苦参素培养液,使其最终浓度为由0.5 mg/mL逐倍增加至8 mg/mL,每个浓度做5个复孔。继续培养24、48、72 h后,加入CCK-8试剂,10 μL/孔,继续培育4 h,置于酶标仪上测定450 nm处的吸光度。计算肿瘤细胞抑制率。

1.2.2 HPLC法研究OM对HepG2细胞能量代谢的影响 流动相:甲醇(99︰1)︰100 mmol/l磷酸盐缓冲液,柱温:30 ℃,进样量:20 μL,流速:0.6 mL/min,检测波长:254 nm。色谱柱:C18色谱柱(4.6×250 mm,粒径5 μm)。使用ATP标准品得出色谱图,同时应用回归方程建立标准曲线。

1.2.2.1 细胞培养 分组:实验组(1.0 mg/mL OM)及阴性对照组(加培养基);取对数生长期细胞1瓶进行细胞计数,接种到4孔板中,每孔加入细胞密度1×106/mL。培育细胞贴壁进行实验。

1.2.2.2 细胞上清液乳酸含量测定:加入不含血清的GFM、GM进行培养,每孔3 mL,每8小时抽取100 μL上清液测定。同时实验组在24 h分别加入或不加入2 μg/mL AntA后每8小时抽取500 μL上清液测定。

1.2.2.3 细胞内ATP含量测定 用PBS水重悬1 mL,取1×105个细胞进行检测,1 500 rpm离心5 min,重悬于0.5 mL预冷的纯净水,按纯净水与6%三氯乙酸体积1︰1沉淀蛋白,涡旋、离心,条件为(4 ℃低温、130 000 r/min、10 min)。HPLC测定细胞内ATP含量。

1.3 统计学处理 使用SPSS 17.0统计软件进行分析,计量资料以(x±s)表示,比较用t检验,多组均数间比较采用单因素方差分析,两两比较用SNK法,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 倒置显微镜下观察OM对HepG2细胞生长的影响 将HepG2细胞接种到96孔培养板中,待细胞贴壁后加入OM,每24小时观察一次,发现OM对HepG2细胞的抑制作用随作用时间、药物浓度增加而更加显著,见图1、2。

2.2 CCK-8法测定不同浓度OM作用HepG2细胞48、72 h增殖抑制的影响 实验表明OM对肝癌细胞增殖抑制率随药物浓度的增加和作用时间延长显著增加(P<0.05或者<0.01),见表1。

2.3 乳酸含量测定 HepG2细胞经1.0 mg/mL IC50OM作用后GM培养基中乳酸增长的速率下降了3倍,GFM下降1.5倍;HepG2细胞经抗霉素A作用后GM培养基中乳酸增长的速率增加1.7倍,GFM增加5倍,差异有统计学意义(P<0.05),见表2。

2.4 细胞内ATP含量测定 经不同浓度苦参作用HepG2细胞48 h后各实验组细胞内ATP含量低于对照组,比较差异有统计学意义(P<0.05),见表3。

3 讨论

肝癌发病率位居于全球第六位[5]。每年有超600 000例被诊断出肝癌,同时其死亡人数与其相当[6]。超过四分之三的患者发生在东亚,其中我国约占50%[7]。目前原发性肝癌的治疗手段主要为手术。但约80%肝癌患者在诊断出已属于中晚期同时合并有肝硬化失代偿期,失去手术机会[8]。因此目前肝癌的治疗仍缺乏有效的手段,常以手术辅助放、化疗等综合治疗为主,但化疗毒副作用大且易产生耐药,中药抗肿瘤毒副作用少且有效,同时增强机体免疫力而受到重视。

苦参素又名氧化苦参碱,多项实验证明苦参素有抗癌作用[9-10],但目前作用机制仍未能完全阐述。近来研究发现MicroRNA是关键的代谢调节剂,能对肿瘤细胞糖、脂肪、氨基酸代谢的关键分子加以调控,从而直接或间接参与癌症的代谢[11]。MicroRNA122是肝脏含量最丰富的miRNA,占肝脏miRNA70%,但在肝癌细胞组织中明显下调[12]。多项研究表明MicroRNA122与肝癌的发生发展关系密切[13]。研究表明其能降低肝癌细胞活力、促进癌细胞凋亡。同时笔者前期实验表明苦参素可使肝癌细胞内MicroRNA122上调[4,14],而MicroRNA122在肝脏代谢中发挥着重要的作用。丙酮酸激酶( pyrurate kinase,PK)有两种亚型M1、M2,PKM2在HCC细胞有氧糖酵解中起重要作用,为肝癌的生长增殖提供保障[15],而Liu等[16]发现MircoRNA122与PKM2成反比,因此,上调HHC中的MircoRNA122有可能抑制HHC有氧糖酵解。目前关于苦参素对肝癌细胞能量代谢研究的实验报道较少。

王淑静等[9]研究OM对人胃癌细胞SGC7901及人脐静脉内皮细胞ECV304细胞增殖抑制作用,得出当药物浓度达0.4 mg/mL时对两种细胞具有明显抑制作用,且具有时间-浓度依賴性。本研究采用CCK-8法发现药物浓度达1 mg/mL以上抑制HepG2细胞增殖,同时随时间、药物浓度增加抗肿瘤作用增加,与王淑静等[9]研究结果一致。

肿瘤细胞通过改变新陈代谢基因编码使其利于生长、生存及增殖,这种代谢改变的共同特点:依赖糖酵解供能,促进葡萄糖的摄取、使葡萄糖发酵为乳酸。这种现象被称Warburg效应。为什么肿瘤细胞选择低产能的有氧糖酵解方式一直是科学家的谜团,尽管有氧糖酵解产能效率低下,但肿瘤组织通过有氧糖酵解的葡萄糖代谢速率更高,这种代谢途径使得葡萄糖产生乳酸的速率较氧化磷酸化快10~100倍[17]。同时有氧糖酵解过程中产生许多中间代谢产物如:NADH、NADPH,可以作为细胞增殖的重要原料。在肝癌组织可以利用有氧糖酵解产生的ATP及和中间产物,供其快速生长[18]。同时大量乳酸生成,导致酸性微环境,有利于肝癌细胞生存[19]。因此,基于肿瘤细胞能量代谢为靶点的药物,有望成为恶性肿瘤临床治疗的新的突破口。近来研究发现MircoRNA是关键的代谢调节剂,直接或间接参与癌症的代谢。MicoRNA122在肝脏的能量代谢起重要的调节作用,笔者前期实验发现OM能上调HepG2细胞MicoRNA122基因[4],因此使得OM能调节HepG2能量代谢成为可能。

胡修明[20]实验表明苦参素抑制K562肿瘤细胞增殖的机制可能抑制细胞内丙酮酸激酶活性从而阻断糖酵解途径。笔者研究中发现HepG2细胞经1.0 mg/mL OM作用后乳酸增长的速率在GM下降了3倍、GFM下降1.5倍(P<0.05),提示苦参素可以抑制糖酵解,使细胞培养上清液乳酸生成速率下降。同时HepG2细胞经过不同浓度OM作用48 h后,相比阴性对照组,细胞内ATP含量呈现下降趋势,与前者实验相吻合[20]。同时细胞内ATP含量随OM浓度增加而逐渐下降,与文献[21]报道抑制肿瘤细胞ATP合成可抑制细胞增殖一致。本次研究发现OM抑制HepG2细胞增殖与影响肿瘤细胞能量代谢有关,表明OM抗肿瘤作用药理机制可能通过影响HepG2细胞有氧糖酵解。

作为实验性研究,本实验仍有较多需进一步完善地方如:没有检测OM对有氧糖酵解关键酶如丙酮酸激酶活性影响;没有进一步研究OM作用HepG2细胞后影响MircoRNA122表达与有氧糖酵解的关系。综上所述,OM能抑制HepG2细胞增殖,其可能的机制是抑制细胞有氧糖酵解使细胞内ATP含量下降有关。

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(收稿日期:2018-03-13) (本文编辑:周亚杰)