云斑尖塘鳢烂身病病原分离鉴定及药敏试验

麦耀宝，陈智光，陈灼均，李本旺，林 强

（1.东莞市长安镇农业技术服务中心，广东 东莞 523850；2.东莞市水生动物防疫检疫站，广东 东莞 523126；3.中国水产科学研究院珠江水产研究所，广东 广州 510380）

云斑尖塘鳢（Oxyeleotris marmoratus），隶属鲈形目虾虎鱼亚目塘鳢科尖塘鳢属，产于柬埔寨、泰国和越南等国，是热带、亚热带的优质淡水鱼之一[1]，因其肉质细嫩、味道鲜美、营养价值高而广受消费者的喜爱。然而，随着近年来集约化养殖程度的提高，云斑尖塘鳢的各种病害频繁发生，如虹彩病毒、弹状病毒、烂身、黑身、打转、肝胆综合征、寄生虫病等[2]，其中烂身病在云斑尖塘鳢养殖过程中非常常见，但是其原因一直不清楚。维氏气单胞菌是水产养殖中的一种常见条件致病菌，可感染多种水生动物，如草鱼、鲤鱼、鲫鱼、罗非鱼、中华绒蟹、鲟鱼、叉尾鮰、鳗鲡等[3-12]，给我国水产养殖业造成了巨大的损失。2017年4月东莞市某养殖场云斑尖塘鳢发生出血烂身症状，每天死亡30～50尾鱼。病鱼主要症状为体表浮肿、鳍条、肌肉糜烂，肝脏发白、脾脏肿大。本研究首次对该病的病原进行分离鉴定，从患烂身病的云斑尖塘鳢中分离到优势菌株WSQ-01，回归试验证明该菌可以复制出烂身症状，对云斑尖塘鳢具有较高致病性。通过测定其16S rRNA序列并结合系统发育学分析，结果证实烂身病为致病性维氏气单胞菌感染所致，并进一步研究了该菌株的药敏特性，以期探讨云斑尖塘鳢烂身病的病原并为该病的防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试剂：脑心浸出液琼脂培养基购自北京陆桥有限责任公司，按照说明配制；血平板购自广东微生物科技有限公司；药敏纸片购自浙江杭州天和微生物试剂有限公司；细菌DNA试剂盒、PCR反应体系均购自天根生化科技（北京）有限公司；生化鉴定试剂条ID32E购自法国Biomerieux公司。

16S rRNA通用引物：上游引物16SF：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′，下游引物16SR：5′-CTACGGTTACCTTGT TACGAC-3′，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

试验鱼：云斑尖塘鳢病鱼10尾取自广东东莞某养殖场，体长15（±3）cm；健康的云斑尖塘鳢100尾，体长15（±2）cm购自东莞市松湖水产养殖有限公司，暂养在水池中，水温保持在28（±2）℃，24 h连续不间断充氧。

1.2 试验方法

1.2.1 病原的分离与纯化 选取具有典型发病症状的云斑尖塘鳢濒死鱼，无菌水冲洗体表后，用75%酒精棉球擦拭体表，在无菌条件下用接种环取病鱼的肝脏、脾脏、肾脏和肌肉样品，划线接种血琼脂平板，28℃恒温培养24 h；挑取优势菌落，在脑心浸出液琼脂培养基上纯化培养2次。

1.2.2 病原菌分子鉴定 将纯化后的细菌WSQ-01接种于BHI液体培养基，28℃摇床培养过夜，提取其DNA作为PCR反应模板。根据预期扩增长度1 500 bp，PCR反应体系共50 μL，包括：PCR 反应液（含 Buffer、4×dNTP、Mg2+、Tap聚合酶）25 μL，上下游引物各1 μL，Tap聚合酶1 μL（5 U/μL），DNA 模板 2 μL，RNA-Free水 21 μL。PCR 反应条件：95℃预变性5 min，94℃变性40 s、53℃复性45 s、72℃延伸90 s，共30个循环，最后72℃延伸8 min。PCR反应结束后，产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测并用胶回收试剂盒回收纯化（OMEGA公司）。回收产物连接到pMD18-T载体中（Takara公司），转化大肠杆菌感受态细胞，PCR鉴定挑选阳性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

1.2.3 系统进化树的构建 将获得的序列与NCBI网站GenBank库中的邻近种属的16S rRNA基因序列进行相似性比较。根据结果，从 GenBank数据库选取与所分析的细菌基因序列同源性较高的已知相关序列，采用MEGA 5.20软件进行多重序列匹配分析，用邻接法（Neighbor-Joining，NJ）构建系统进化树。

1.2.4 回归感染试验 试验随机放置健康的云斑尖塘鳢30尾，用分离到的菌株进行腹腔注射，菌液浓度为4.0×107CFU/mL，注射剂量为0.2 mL/尾，用生理盐水进行腹腔注射作对照。连续7 d观察和记录各组鱼的发病和死亡情况，并对濒死鱼体及时进行解剖和病原菌的再次分离。

1.2.5 药敏实验 将分离到的菌株培养24 h并制成108CFU/mL的菌悬液。取100 μL菌液均匀涂布于脑心浸出液琼脂培养基平板上，然后用无菌镊子将药敏纸片紧贴在培养基表面，于28℃下恒温培养24 h。记录各药敏纸片抑菌圈的直径，根据药敏纸片生产厂家推荐的抑菌范围解释标准判断实验结果。

2 结果与分析

2.1 病原菌的分离纯化

从患病的云斑尖塘鳢肝脏、脾脏、肾脏和肌肉中均分离到数量较多且形态一致的菌落。这些菌株在血平板可形成明显的β溶血圈，在脑心浸出液琼脂培养基平板上呈有光泽的圆形白色或灰白色菌落，表面湿润、光滑、微隆起、边缘整齐，显微镜下为革兰氏染色阴性的短杆菌。

2.2 分子鉴定

用16S rRNA通用引物扩增这些菌株的DNA，获得长度约1 500 bp的片段。将测定的菌株序列递交到GenBank中进行Blast同源性分析，结果表明，所测基因序列均为相同序列，说明这些菌株都是同一菌株，命名为WSQ-01，与已登陆的维氏气单胞菌的16S rRNA相应基因序列的同源性均为99%；所测基因序列与GenBank中已登录的气单胞菌属的常见种进行比对，结果表明H WSQ-0与维氏气单胞聚为一簇，故确定该菌为维氏气单胞菌。序列比对的同源性分析与进化树构建如图1所示。

图1 菌株WSQ-01 16S rRNA基因序列构建的系统进化树

2.3 回归感染试验

通过腹腔注射对健康云斑尖塘鳢鱼进行人工侵染，结果发现，感染后7 d内死亡18尾鱼，感染7 d后鱼不再死亡，累计死亡率为60%。发病鱼的症状为呼吸加快，在水中活力减弱，部分鳍条有出血现象，部分出现烂身症状。在无菌条件下，从人工感染发病的云斑尖塘鳢肝脏中分离的菌株16S rRNA基因序列与WSQ-01株16S rRNA基因序列相同，表明WSQ-01是云斑尖塘鳢烂身病的致病性病原。

2.4 药敏试验

用 K-B 法对WSQ-01进行药物敏感性测试，在13种供试药物中，四环素、强力霉素、红霉素、氟苯尼考、利福平、头孢他啶、氧氟沙星、左氟沙星和恩诺沙星对该菌的作用较强，说明细菌对这10种药物敏感，而对氨曲南、链霉素和阿莫西林具有耐药性（表1）。

表1 菌株WSQ-01对不同抗菌药物的敏感性

3 结论与讨论

云斑尖塘鳢从20世纪80年代引入我国以来，因其味道鲜美、营养丰富和经济价值高，深受广大养殖户和消费者的喜爱。但是随着养殖规模和养殖密度的增加，云斑尖塘鳢的病害也越来越多，其中云斑尖塘鳢的烂身在养殖过程中非常普遍，在整个养殖过程中都有发生。2017年3月，东莞市某云斑尖塘鳢养殖场的云斑尖塘鳢一直以来陆陆续续出现死亡，发病的鱼大多出现鳍条烂，肌肉糜烂、脾脏肿大等症状，多种药物的治疗效果都不明显。本试验对烂身的云斑尖塘鳢进行致病菌分离和鉴定，通过对该菌的16S rDNA与其他维氏气单胞菌的同源性检测，初步将该菌确定为维氏气单胞菌，并通过回归感染实验证实了维氏气单胞菌为该病的病原。

维氏气单胞菌属于气单胞菌属，气单胞菌是一种在水产养殖中常见的革兰氏阴性菌。气单胞菌广泛分布于自然界中，是一种世界性分布的条件致病细菌，可引起多种疾病的发生。水产养殖常见的气单胞菌包括嗜水气单胞菌[3]、维氏气单胞菌[4]、温和气单胞菌[14]、豚鼠气单胞菌[15]、舒氏气单胞菌[16]、杀鲑气单胞菌[17]等。其中维氏气单胞菌可以造成动物的局部出血和炎症，严重时可造成败血症，危害严重，在草鱼、鳜鱼、加州鲈、中华绒蟹、鲟鱼、鲤鱼、叉尾鮰、鲫鱼、鳗鲡、罗非鱼等水生生物上均分离到该致病菌[3-12]。据文献报道，从烂身的水生动物中，除了可以分离到维氏气单胞菌，还可以分离到嗜水气单胞菌、温和气单胞菌和杀鲑气单胞菌等。由此可见，烂身可能并不是由特定某种病原造成的，而是由于鱼体体表受损导致病原菌入侵，细菌在局部增殖，造成感染部位的损伤，出现烂身和溃疡症状，继而细菌通过血液进入内脏组织，大量繁殖产生毒素造成鱼体死亡。

维氏气单胞菌有多种血清型，每个区域每个季节流行的株型可能都不一样。本试验虽然进行了WSQ-01株的药敏试验，结果表明该菌对多种药物敏感，生产上可以用恩诺沙星等进行治疗。维氏气单胞菌是一种条件致病菌，当水环境变差、机体应激、受伤或免疫力下降时均可能导致感染该菌。本研究调查发现，开春拆棚时的应激、长期投喂冰鲜饵料、水质恶化等均可能导致云斑尖塘鳢烂身的发生，因此合理规划放养密度，加强水质和底质的管理，增强鱼体免疫力，也是防控此病的重要措施。