利心冲剂对心力衰竭大鼠心肌ATP及PCr/ATP比值的影响

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慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)是一种复杂的临床综合征，常继发于遗传性或获得性心脏结构、功能的异常。研究表明，除了神经内分泌的激活，心肌能量代谢障碍也与慢性心力衰竭的发生和发展有关，改善能量代谢或将成为心力衰竭治疗新的靶点。既往研究显示，中药利心冲剂可有效缓解病人心力衰竭症状，提高运动耐量[1]。其对大鼠心力衰竭模型的作用，表现为调控神经内分泌及炎性相关因子[2]，减轻心肌细胞凋亡[3]，改善心脏功能。为了深入研究中医药治疗心力衰竭的机制，本研究观察了利心冲剂对心力衰竭大鼠能量指标的影响，探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 无特定病原体(SPF)级SD大鼠，雄性，体重200 g～260 g，由浙江省实验动物中心提供，许可证号：SCXK(浙)2014 -0001。

1.2 药品与试剂 利心冲剂：由黄芪30 g、黄精15 g、补骨脂12 g、葶苈子12 g、益母草30 g组成，采用江阴天江药业有限公司生产的免煎颗粒。三磷酸腺苷(ATP)、磷酸肌酸(PCr)酶联免疫吸附(ELISA)检测试剂盒由上海源叶生物科技有限公司提供，批号：1600526。

1.3 建模及分组 参照文献[4]，采用腹主动脉缩窄法制备心脏压力负荷超载心力衰竭模型：SD大鼠术前禁食8 h，称重，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，剪毛，开腹，暴露腹主动脉，将8号注射器针头磨钝，平行置于腹主动脉上，用4号手术线将腹主动脉和注射器针头一同结扎，然后缓慢撤出注射器针头，关腹，分层缝合。假手术组除不结扎外，其他步骤与建立心力衰竭模型大鼠相同。术后予青霉素腹腔注射5 d，预防感染。手术成功2周后，存活大鼠中随机选取2只，断头处死，取出心脏，用预冷生理盐水冲洗，取左心室心肌部分，以10%甲醛固定，HE染色，光镜下观察确认造模成功。

建模成功后将SD大鼠随机分为4组， ①假手术组：等体积双蒸水灌胃；②模型组：等体积双蒸水灌胃；③利心冲剂低剂量组：用利心冲剂20 g/kg灌胃；④利心冲剂高剂量组：用利心冲剂40 g/kg灌胃。每组10只，每日1次，连续28 d。

1.4 观察指标

1.4.1 心肌病理形态 给药结束后，处死大鼠，取左室心肌部分，经10%甲醛固定、取材、脱水、浸蜡、包埋，再切成4 μm厚切片，HE染色，光镜观察。

1.4.2 心肌匀浆ATP、PCr检测 称取心肌组织1 g，以2∶1比例加入冷PBS(4 ℃)，匀浆器迅速制备心肌匀浆，3 000 r/min离心5 min，取上清液，-70 ℃温箱保存。按ATP、PCr的ELISA检测试剂盒操作说明书进行。

2 结 果

2.1 心肌细胞病理学检测 假手术组心肌细胞形态正常，胞浆纹理清晰；模型组心肌细胞肥大，部分心肌细胞轻度脂肪变性，部分心肌细胞肌浆凝聚、核固缩、间质出血；利心冲剂高剂量组心肌细胞结构与正常相似。详见图1。

图1 大鼠心力衰竭模型心肌细胞病理学检测

2.2 利心冲剂对大鼠心肌匀浆ATP及PCr/ATP的影响 与假手术组比较，模型组、利心冲剂低剂量组ATP含量显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，提示心力衰竭时细胞内ATP含量呈下降趋势。与模型组比较，假手术组与利心冲剂高剂量组PCr/ATP明显升高(P<0. 05)，差异有统计学意义(P<0.05)，说明利心冲剂治疗能够提升细胞中的PCr/ATP比值。详见表1。

表1 各组大鼠ATP及PCr/ATP比较(±s)

3 讨 论

人口老龄化以及高血压病、冠心病等心血管病发病率的上升，导致心力衰竭的患病率逐年增加。近20年来，心力衰竭治疗取得了长足的进步，随着血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)、血管紧张素Ⅱ受体阻断剂(ARB)、β受体阻断剂、盐皮质受体拮抗剂等药物的广泛应用，提高了病人生活质量，降低了病死率，使心力衰竭的结局发生了极大的变化。但是，现有的治疗手段尚不能阻止心力衰竭的发展进程。

对心力衰竭发生机制的研究，目前主要集中在神经内分泌激活及其所致的心肌重塑。有学者提出，心肌能量代谢障碍和心力衰竭密切相关。资料显示，心力衰竭时心肌中ATP酶的活性下降，线粒体结构异常，氧化磷酸化过程受损，可使心肌能量的利用发生障碍，最终导致心肌的收缩储备降低[5]。除了ATP的合成障碍，ATP传输障碍亦可影响心肌细胞对能量物质的利用。PCr是哺乳动物体内主要的磷酸胍类化合物，是心脏内能够迅速动用的能量储备[6]。在肌酸激酶的作用下PCr与ATP间能够完成快速的髙能磷酸键转换，为心肌供能。PCr/ATP是衡量心肌能量储备的关键指标[7]。

长期的临床实践使得中医对慢性心力衰竭病理机制的认识趋于一致：心之气阳亏虚为本，血瘀、水停为标，故治疗以益气温阳为主要大法，佐以活血、利水。利心冲剂由黄芪、黄精、补骨脂、葶苈子、益母草药物组成，其中黄芪补益心气，兼以利水，黄精、补骨脂温补心肾气阳，益母草活血利水，葶苈子泻肺利水。其临床应用取得了满意的效果，可改善心力衰竭病人的症状，提高运动耐量[1]。前期的机制研究显示，利心冲剂对大鼠心力衰竭模型心肌细胞具有抑制神经内分泌和炎性相关因子的表达；提高超氧化物歧化酶(SOD)活性，减轻氧化损伤；抑制凋亡信号传导通路p38 MAPK，改变凋亡相关基因Bcl -2/Bax比值，抑制心肌细胞凋亡；调控心肌组织TIMP -1的表达，抑制由TGF -β诱导的心肌胶原沉积和纤维化，使心室重构得到一定程度的延缓或逆转[8]。

本次实验结果显示：与假手术组比较，模型组与利心冲剂低剂量组ATP含量下降，提示心力衰竭时大鼠心肌细胞存在能量代谢障碍。与模型组比较，假手术组与利心冲剂高剂量组PCr/ATP明显升高，表明利心冲剂能够改善心肌能量储备，从而改善心肌细胞的能量代谢，可能是利心冲剂治疗心力衰竭的机制之一，或为中医药改善心力衰竭新的治疗靶点，为中医药治疗心力衰竭提供了新的思路。