超高效液相色谱串联质谱法测定鸡肝脏中的马杜霉素

□ 孙转莲 祝伟霞 张 丹 冯景菲 河南检验检疫鉴定咨询中心

马杜霉素（Maduramicin），又名马度米星，属于聚醚类抗生素，是用药剂量最小的聚醚类抗球虫药，常用于肉鸡球虫病。聚醚类离子抗生素在动物体内分布广泛，绝大部分药物及其代谢产物经胆管排出体外，其中，肝脏和脂肪残留物浓度最高，其次为肾脏、鸡肉和血浆［1］。残留在鸡肝脏中的药物，为食品安全带来不安全因素。摄入残留有马杜霉素的食物会引起人血管舒张，特别诱发心脏冠状动脉扩张和血流量增加。现有的方法主要针对组织（猪肉、鸡肉、牛肉等）中马杜霉素的检测，对于肝脏中的马杜霉素的检测文献报道较少。本文建立了以乙腈提取，经HLB固相萃取柱净化，超高效液相色谱-串联质谱检测的分析方法，解决了鸡肝脏基质复杂，基质效应较大，灵敏度低的问题。根据《动物性食品中兽药最高残留限量》规定马杜霉素在鸡肝脏中的最高残留限量为720 µg/kg［2］，本方法可满足要求。

1 材料和方法

1.1 材料、仪器及试剂

材料：市售鸡肝脏。

仪器：三重四极杆串联液相色谱-质谱仪（API 5500Q，美国应用生物公司，包括Waters classⅠ液相色谱仪；电子天平（AB265-S，梅特勒·托利多，瑞士）；电子天平（xp-204，梅特勒·托利多，瑞士）；组织绞碎机；振荡器；低速离心机；氮吹仪；超声波清洗器。

试剂：乙腈（99%，默克，色谱纯）；甲醇（99%，默克，色谱纯）；HLB柱（Waters，3cc/60mg）；马杜霉素（Dr.Ehrenstorfer GmbH； ≥ 91.0%）；去离子水。

1.2 方法

1.2.1 样品前处理

称取5.00g（精确至0.01g）试样于50 mL具塞塑料离心管中，加入10 mL乙腈提取，涡旋5 min，超声10 min，4000 r/min离心10 min，取上清液，在残渣加入10 mL乙腈重复提取一遍，合并上清液，于45℃水浴中氮气吹干，用30%甲醇/水溶解残渣，待净化。将溶解液过HLB柱，用30%甲醇/水淋洗，负压下抽干。用3mL甲醇洗脱，于45℃水浴中氮气吹干，用1mL甲醇水（v+v,7+3）溶解残渣，供液相色谱串联质谱测定。

1.2.2 马杜霉素测定

以外标法定量。取峰面积为纵坐标，溶液浓度为横坐标绘制标准曲线，用工作曲线对样品进行定量。马杜霉素总离子流图及提取离子流图如图1、图2所示。

1.2.3 仪器条件

1.2.3.1 液相色谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18， 1.7μm；2.1mm×50mm。流动相：甲醇-0.1%甲酸水溶液，由1.5 min 40 %甲醇到90 %甲醇，保持3.5min，回到初始位置。流速：0.3 mL/min。柱温：30℃。进样量为 10 μL。

1.2.3.2 质谱条件

质谱采用电喷雾离子源、正离子扫描、多反应监测（MRM）检测方式：雾化气 50 psi；气帘气25psi；辅助加热气60 psi；喷撞气Medium；辅助加热气温度550℃； 喷雾电压5500V； 出口池电位CXP，12V。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

将标准溶液依次从低浓度到高浓度进样，按其所得到的峰面积和对应的标准溶液质量浓度（ng/mL）做工作曲线，得到回归方程和相关系数。试验在2～200 ng/mL质量浓度范围内，回归方程为y=1.18e+003x+3.92e+003，相关系数r=0.9983，满足分析要求。

图1 马杜霉素总离子流图

图2 马杜霉素提取离子流图

2.2 色谱条件的确定

试验分别以甲醇-0.1%甲酸水溶液和乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相比较，以ACQUITY UPLC BEH C18，1.7µm，2.1mm×50mm柱 和ACQUITY UPLC HSS T3，1.8 µm，2.1 mm×10 mm 液相色谱柱为对比，得到色谱条件：以甲醇-0.1%甲酸水溶液为流动相，使用BEH柱，流速为0.3 mL/min；柱温30℃；进样量为10 µL,得到的色谱峰形良好，峰型尖锐，且无拖尾现象。

2.3 质谱条件的确定

马杜霉素在化学结构上，通过含有若干环状醚键，分子一端有一羧基，分子两端借助氢键相连而生成环状结构后，容易与Na+、K+等离子结合生成亲脂性络合物[3]。试验中100 ng/mL的标准溶液，在ESI+模式下进行母离子全扫描，未出现m/z 为[M+1]+的分子离子峰，得到的是[M+23]+处的离子峰很强，优化准分子离子（[M+23]+）的去簇电压和碰撞能量，选择得到两个信号强度较大的碎片离子作为特征离子，最后以多反应监测（MRM）的模式优化各种参数。具体参数见表1。

2.4 回收率与精密度试验

取5份空白鸡肝脏样本，按照样品前处理得到空白基质溶液，用空白基质溶液配制标准曲线进行回收率和精密度的试验，结果表明：马杜霉素3个质量浓度的添加水平（2.0、5.0、10.0 µg/kg）6个平行样品的回收率在78.5%～108.6%，批内变异系数均小于12.3%，具体参数见表2。

表1 定性离子对和定量离子对

表2 鸡肝脏中添加3个水平的回收率和变异系数

2.5 检测限的确定

样品添加浓度为1.0 µg/kg,马杜霉素的信噪比S/N＞3（按峰对峰计），表明方法的检测限可定为1.0 µg/kg。定量限的确定：添加浓度为2.0 µg/kg，马杜霉素的信噪比S/N＞10（按峰对峰计），表明方法的定量限可定为 2.0 µg/kg。

3 结论

本文采用乙腈提取，HLB柱净化，UPLC分离，建立了鸡肝脏中马杜霉素残留的检测。在进行样品前处理的过程中，使用不同比例的定容液，样品回收率差异较为显著，使用高比例的有机相定容时样品溶解较完全，样品回收率稳定。整个实验过程简单、快速，比较适合大量鸡肝脏样品中马杜霉素的检测。