一例牛传染性鼻气管炎病毒与大肠杆菌混合感染的实验室诊断

于季申，倪宏波，李 鹏

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江 大庆 163000）

牛传染性鼻气管炎（Infectious bovine rhinotra-cheitis，IBR）是由牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）引起的一种急性、热性、接触性牛传染病，传染性鼻气管炎也叫做坏死性鼻炎。在临床上主要表现为高热、呼吸困难、鼻炎和上呼吸道炎症，还可以引起脓包性外阴阴道炎、龟头炎、母牛流产、死胎及犊牛脑炎、共济失调，有时发生结膜炎和角膜炎等症状。IBRV感染宿主细胞的特性与其所含有的病毒蛋白及其诱导宿主细胞的病理反应有密切的关系[1]；IBRV糖蛋白gD是其重要的毒力因子[2]，是主要的诱导宿主细胞凋亡的单纯疱疹病毒1型UL6蛋白区域相似的结构域，提示该蛋白可能与病毒的组装有关，IBRV除了通过呼吸道黏膜上皮及生殖道上皮感染宿主外，也可通过空气及牛之间的接触进行传播，通过一系列方式建立感染[3]。

犊牛大肠杆菌病是由多种血清型的致病性大肠杆菌所引起的急性新生幼犊传染病。多见于2周龄内的初生犊牛，舍饲牛群多发，放牧条件下发病较少，肉牛的发病率高于奶牛[4]。犊牛腹泻大肠杆菌有多种血清型，主要有导致初生犊牛腹泻的O8、O9、O20、O101大肠杆菌，感染犊牛发生败血症的O78、O15、O35、O115、O117、O137等血清型大肠杆菌[5]犊牛腹泻是出生后至1个月内犊牛因不适应外界环境某些不良因素的影响而发生的一种以消化不良、腹泻为主要症状的消化道疾病，并以4～10日龄为多发，病犊以体温升高（消化不良型腹泻初期体温没有明显变化）、腹泻、脱水、自体中毒及心力衰竭为主要特征，是造成犊牛死亡的主要疾病之一[6]。很多急性犊牛腹泻是由细菌和病毒混合感染而引起的，而这些细菌和病毒在健康犊牛肠道内是普遍存在的。在细菌性腹泻病中，由大肠杆菌引起的腹泻占据首位[7-9]。由于犊牛腹泻在许多养牛业发达的国家都有发生，给畜牧业带来了巨大的经济损失[10]。长期以来抗生素和化学治疗药物是防治该病的常用药物，并取得了良好的效果[11]。

本试验根据对军川牧场完达山牧业某牛场的流行病学调查以及送检的9个牛粪便样本和9个牛口鼻分泌物的PCR病原鉴定、平板培养基划线法的细菌分离鉴定和药敏试验确诊其发病原因是该牛同时感染牛IBRV病毒和大肠杆菌，肉牛传染性鼻气管炎也叫做坏死性鼻炎，是由于感染牛传染性鼻气管炎病毒而引发的一种病毒性疾病。犊牛感染病毒后，会呈现潜伏感染或者持续性感染，导致病牛长时间甚至终生携带或者排出病毒，很难彻底控制或者消灭该病，造成较高的死亡率，严重损害养牛业的经济效益，应采取有效的防治措施。在自然感染的条件下，只有牛对该病具有易感性，通常是育肥肉牛容易发生。该病往往呈急性发生，具有传染性，该牛场环境消毒不合格，免疫程序混乱，没有经过科学的疫苗免疫程序，这些因素给病原提供大量繁殖并发生变异的机会，造成IBRV病原存在牛只体内，没有及时确诊，带病牛没有被及时隔离导致大规模的病毒扩散和传播，从而大规模牛群体感染IBRV病毒，该牛场饲养管理水平低，饲养密度大，饲料不科学；排泄物没有无害化处理，导致造成大肠杆菌细菌感染，现将诊断过程汇报如下。

1 材料与方法

1.1 病料的采集 军川牧场送检的3月龄犊牛粪样和口鼻分泌物样本，实验室无菌采集牛的肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、肠以及血液保存备用。

1.2 试验材料 DL 2000 DNA Marker购自大连宝生物工程有限公司，TIANamp Genomic DNA Kit DNA提取试剂盒购自TIANGEN公司，PCR Master Mix缓冲液，RNeasy Plus Mini Handbook RNA提取试剂盒购自QIAGEN公司，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒购自MBI公司。

1.3 引物设计 根据GenBank中已发表的牛传染性鼻气管炎（Infectious bovine rhinotra-cheitis,IBR）、牛呼吸道合胞体（respirator syncytial）、牛副流感病毒（Parainfluenza virus）、轮状病毒（Rotavirus）、冠状病毒（coronavirus）、腺病毒（Adenovirus）、牛流行性腹泻病毒（Bovine epidemic diarrhea virus）的基因序列设计特异引物。

1.4 细菌分离培养 无菌剪取一小块深部组织脏器，接种涂抹于5%兔血琼脂培养基上，分别做需氧和厌氧培养，置37℃恒温箱中24 h，同时用接菌环挑取肠内容物接种在SS和麦康凯培养基上，置37℃恒温箱中需氧培养24 h，观察菌落形态和溶血情况等，挑取疑似菌的单个菌落进行纯培养。

1.5 核酸的提取与PCR鉴定

1.5.1 口鼻分泌物以及粪便的DNA和RNA提取 按照TIANamp Genomic DNA Kit操作进行提取DNA；按照RNeasy Plus Mini Handbook RNA提取盒进行提取RNA，DNA-20℃保存备用，RNA-80℃保存备用。

1.5.2 RNA反转录和PCR扩增 按RevertAidFirst Strand cDNA Synthesis Kit反转录盒说明书操作步骤将病毒提取的RNA进行反转录，得到的cDNA在-20℃进行保存备用。用得到的DNA和cDNA为模板，牛传染性鼻气管炎、牛呼吸道合胞体、牛副流感、牛轮状病毒、牛冠状病毒、牛流行性腹泻病毒和牛腺病毒特异性引物进行PCR反应扩增，取10 μL的扩增产物于1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

表1 引物序列Table 1 Peimersequence

1.6 细菌药敏试验 将鉴定为大肠杆菌的纯培养物用接种棒均匀涂布在鲜血培养基上，将药敏纸片（盐酸林可霉素、恩诺沙星、恩诺杀星、硫酸庆大霉素、氟苯尼考、氧氟沙星、盐酸头孢噻呋钠、卡那霉素、硫酸链霉素、氨苄西林钠）分别贴于平皿中，37℃培养24 h，测定抑制菌圈直径大小，根据检测标准判定结果。

注：抑菌环直径＜15 mm为低度敏感；≥15 mm为高度敏感。

2 结果与分析

2.1 涂片染色特性 将病料中所分离的细菌进行纯培养，进行革兰氏染色、涂片、镜检。可见到革兰氏染色阴性杆菌，中等大小，直杆菌（见图1）。由于大肠杆菌和沙门氏菌的形态及染色特征十分相似，所以为了区分这两种细菌，又分别接种于SS和麦康凯培养基进行鉴别培养，结果为SS培养基长出深粉色，光泽菌落；麦康凯培养基长出粉色、光滑、圆形菌落（见图2、图3）

图1 革兰氏染色两端钝圆杆状菌（10×10）Fig.1 Gram staining at both ends of blunt rod-shaped baculovirus

图2 SS琼脂培养基深粉色、圆形菌落Fig.2 SS agar medium deep pink and round colony

2.2 PCR检测结果 以组织中提取的病毒DNA以及病毒RNA反转录的cDNA为模板，分别选用牛传染性鼻气管炎、牛呼吸道合胞体、牛副流感、牛轮状病毒、牛冠状病毒、牛流行性腹泻病毒和牛腺病毒特异性引物进行PCR鉴定，轮状病毒、冠状病毒、BVDV病毒、腺病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛副流感病毒无阳性结果（如图4、图5）。其中IBRV病毒结果显示PCR产物在第6孔道和第9孔道与牛传染性鼻气管炎预期片段大小相符（如图6）。

图3 麦康凯培养基 圆形菌落粉红色、光滑Fig.3 Makanke culture base round colony pink and smooth size colony

2.3 细菌药敏试验结果

图 4PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果Fig.4 PCR electrophoresis analysis chart

图5 PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果Fig.5 PCR electrophoresis analysis chart

图6 PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果Fig.6 PCR electrophoresis analysis chart

表2 药敏结果Table 2 The results of drug susceptibility

3 讨论

3.1 发病原因 对该牛场牛犊的发病原因进行调查：该牛场饲养管理水平低，饲养密度大，饲料不科学；环境消毒不合格，排泄物没有无害化处理；免疫程序混乱，没有经过科学的疫苗免疫程序。这些因素给病原和细菌提供大量繁殖并发生变异的机会，牛只被IBRV病原感染，没有及时诊断对症治疗或隔离，造成牛场牛群大规模病毒传播扩散，牛群感染IBRV。

3.2 防治措施 牛传染性鼻气管炎的治疗目前尚无特殊药物和疗法，根本的办法是消灭传染源，对健康牛进行免疫注射。因此采取检疫、隔离、封锁、消毒等综合性措施。应坚持自繁自养原则。为防控该病，要进行无害化处理，被污染的圈舍、器具要进行消毒，粪便要进行堆积发酵处理，牛场环境要经常消毒，疫情严重威胁时，每天消毒1次，连续消毒1周，以后夏天每周2次，冬天1次；牛舍净化。在多数牛场尚无多点生产体系情况下，保育舍和育肥舍要做到单元式全进全出生产管理，即每个牛舍的用具、人员等要独立，用具不可共用，人员不要来往[12-13]。

应定期对牛群进行血清学监测，对阴性牛可采取疫苗注射，阳性牛如果数量较少，可及时淘汰，集中饲养，对已发病的犊牛应予以屠宰。而对发病死亡的牛尸体必须进行无害化处理[14-15]。

4 结论

通过对牛场牛的病情和实验室诊断，确诊送检的病死牛死亡原因是该牛感染了牛传染性鼻气管炎和大肠杆菌，该牛场病牛呼吸困难、流鼻涕、高死亡率具有牛传染性鼻气管炎的典型特征，腹泻拉稀具有大肠杆菌感染的特征，呼吸系统疾病和消化道系统疾病混合感染往往很难治疗，牛传染性比气管炎具有高度的传染性，要想防治该病毒发生和扩散，必要时要及时进行实验室诊断，及早隔离带病牛进行规模化消毒隔离饲养，一旦遇到犊牛与该病有相似症状要及时对症治疗。