长白山野生松针粉抗氧化及抗衰老作用的研究

孟永海，怀雪，翟春梅，李廷利，卞宏生，马智超，孟祥瑛，王艳艳，，*

（1.黑龙江中医药大学教育部北药基础与应用研究重点实验室，黑龙江哈尔滨150040；2.黑龙江中医药大学中药药理实验室，黑龙江哈尔滨150040）

松针（pineneedle）为松科松属植物的叶，别名猪鬃松叶、松毛、山松须[1]。松针历史悠久，《本草纲目》记载“松针，气味苦、温、无毒，久服令人不老，轻身益气，主治风湿疮，生发，安五脏，守中，不饥延年。松针内富含糖类、粗蛋白、粗脂肪、氨基酸和微量矿物元素、维生素、抗菌素、生物黄酮类物质、莽草酸、精油、叶绿素、木脂素、不饱和脂肪酸、酶与辅酶等营养素和活性物质，具有很高的营养价值和药用价值。松针的主要药理活性有抗血小板聚集活性，降血脂，降血糖，镇痛抗炎，祛痰及平喘，抗氧化，抗肿瘤，抗病毒，抗菌，抗突变效应，抗疲劳等药理作用[2]。其活性成分和药理作用决定了松针在食品保健方面的特殊性。早在上世纪90年代，将松叶的有效成分溶解于贵酿酒中，使该酒具有护肝、延缓衰老、降压利尿等功效[3]。近年来，松针开发成含维生素C、维生素B1、维生素B2等对人体保健大有益处的松针饮料，具有润肺益气，除风止痛的松针茶，用松脂提取的天然香料等[4]。本文以衰老小鼠和果蝇为生物模式，对长白山野生松针的抗氧化及抗衰老作用进行研究，为其功能食品的研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物

美国癌症研究所（Institute of Cancer Research，ICR）雄性小鼠10只，ICR雄性老龄鼠20只，体重（20±2）g：均由黑龙江中医药大学药物安全评价中心提供；野生型Canton S品系黑腹果蝇：由中国科学院上海生命科学院果蝇技术平台提供。

1.2 试剂与仪器

松针：产自吉林长白山；MDA试剂盒、SOD试剂盒、BCA试剂盒、GSH试剂盒（批号均为20170809）：南京建成生物研究所；FJ-200高速万能粉碎机：上海申胜仪器公司；HH.WZ.CY600电热恒温水浴锅：上海精宏实验设备公司；CT15RE高速冷冻离心机：日本HITACHI公司；AL 204电子天平：美国METTLER TOLEDO公司；EVOLUTION 260紫外分光光度计：美国THERMO公司；EPOCH12酶标仪：美国BIOTEK公司。

2 试验方法

2.1 小鼠抗氧化实验

选取ICR青年与老年小鼠30只，按照文献方法加以改进[5]，分3组即老年给药组、老年模型组、青年对照组。松针粉碎过筛，按照散剂配制[6]，给药剂量为5 g/kg，给药30 d。老年模型组、青年对照组给等体积的生理盐水。末次给药后，眼球取血，低温离心，硫代巴比妥酸法测定血清中丙二醛（malondialdehyde，MDA）、羟胺法测定血清中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的含量。冰上取肝组织，微板法测定肝组织中蛋白定量（bicinchoninic acid，BCA）[2]、比色法测定谷胱甘肽（glutathion，GSH）的含量。

2.2 果蝇寿命的实验

果蝇培养基的制备采用基础培养基配方：蒸馏水46 mL，玉米粉 4.2 g，蔗糖 3.1 g，琼脂 0.3 g，在培养基中添加不同剂量（高1.845%、中0.461%、低0.115%）的松针粉，对照组则给予正常培养基饲养。煮沸至糊状，停止加热，待温度降至60℃～70℃时，加入酵母粉0.3 g，搅拌均匀，加入丙酸0.3 mL，搅拌均匀，立即分装至果蝇管中。参照文献方法加以改进[7-9]，对果蝇行为学进行考察。

2.2.1 寿命实验

收集12 h内羽化成虫的果蝇，随机分为对照组和给药组，每组雌雄各100只，在（25±4）℃、相对湿度为（60±10）%、光/暗时间为12 h/12 h的恒温恒湿智能培养室中培样。每4天更换一次培养基并观察记录果蝇的情况。计算平均寿命，中间寿命，最高寿命。

2.2.2 亚急性氧化损伤实验

取30日龄果蝇，每组雌雄各100只，果蝇饥饿两小时后分别给予含20%的H2O2的6%的葡萄糖溶液，每4小时记录一次，直至果蝇全部死亡。

2.2.3 衰老果蝇的攀爬实验

收集12 h内羽化成虫的果蝇，每组10只果蝇，雌雄各半。于第0、10、20、30天移入空的果蝇管中，观察10 s内攀爬超过8 cm处的果蝇只数。每组重复实验5次。

2.2.4 对果蝇体内水分含量的影响

收集12 h内羽化成虫的果蝇，每组雌雄各50只，饲养至30 d，称初重，放入干燥箱中（55℃），1 h后再次称重，两次重量差即为果蝇体内水分含量。每组重复实验4次。

2.2.5 生殖实验

分别取7、15、30 d蝇，每管雌雄各一只，饲养3 d后取出，记录第1天出生的子代蝇个数，连续记录7 d，每组实验平行6次。

2.3 统计学处理

运用SPSS 17.0软件进行方差分析（analysis of variance，ANOVA）单因素方差分析，数据以±s表示，组间做t检验，P<0.05则表示有显著性差异，有统计学意义，P<0.01为极显著性差异。（果蝇实验中，给药组雌果蝇与空白对照组雌果蝇比较，雄果蝇与空白对照组雄果蝇比较）。

3 结果

3.1 小鼠血清SOD、MDA含量以及肝组织GSH含量

小鼠血清SOD、MDA及肝组织GSH含量见表1。

表1 小鼠血清SOD、MDA及肝组织GSH含量（n=10）Table 1 The content of SOD，MDA，and liver homogenate GSH in mice（n=10）

与老年模型组相比，青年对照组MDA、SOD及肝组织GSH含量均有极显著差异（P<0.01），说明正常生理下衰老小鼠与青年小鼠相比，衰老指标发生明显变化。但老年给药组SOD和GSH含量与老年模型组相比，有显著性差异（P<0.05），MDA含量虽无显著性差异，但有降低趋势。这可能与给药时间不足有关。此实验表明，给与一定剂量的松针粉，可回调衰老小鼠的抗氧化指标，有一定的延缓衰老的效果。

3.2 松针粉对果蝇寿命相关行为学指标考察结果

3.2.1 松针粉对果蝇寿命的影响

松针粉对果蝇寿命的影响见表2。

与果蝇空白对照组相比，各给药组的果蝇平均寿命和最长寿命，均有不同程度的延长，与对照组相比，各给药组雌雄果蝇平均寿命均呈现极显著差异（P<0.01），中、低剂量组雌雄果蝇的最长寿命也呈现极显著性差异（P<0.01）。说明果蝇终身补充一定剂量的松针粉，可延长自身寿命。

果蝇寿命存活率见图1。

表2 松针粉对果蝇寿命的影响（n=100）Table 2 Lifespan parameters in drosophila following pine supplement（n=100）

图1 果蝇寿命存活率折线图（n=100）Fig.1 Graph of drosophila melanogaster’s survival rate（n=100）

3.2.2 松针粉对果蝇亚急性氧化损伤实验

松针粉对果蝇亚急性氧化损伤的作用见表3。

在亚急性氧化损伤实验中，与空白对照组相比高剂量组雌雄平均存活时间呈现极显著性差异（P<0.01）；中剂量组雌雄果蝇呈现显著性差异（P<0.05）；低剂量组均无显著性差异。

3.2.3 松针粉对不同时期果蝇的攀爬活动的影响

松针粉对不同时期果蝇的攀爬活动的影响见表4。

表3 松针粉对果蝇亚急性氧化损伤的作用（n=100）Table 3 Survival time parameters in drosophila exposed to H2O2 following pine supplement（n=100）

表4 松针粉对不同时期果蝇的攀爬活动的影响（n=5）Table 4 Climbing ability in drosophila following pine supplement（n=5）

与空白对照组相比，各给药组10日龄雄果蝇的攀爬能力有极显著性差异（P<0.01），低剂量组雌果蝇攀爬能力显著增加（P<0.05）；高、中剂量给药组20日龄雄果蝇的攀爬能力显著增加（P<0.05或P<0.01），中剂量组雌果蝇的攀爬能力有极显著性差异（P<0.01）；高剂量组30日雄果蝇的攀爬能力有极显著性差异（P<0.01）。果蝇攀爬实验折线图见图2。

3.2.4 松针粉对果蝇体内水分含量的影响

松针粉对果蝇体内含水量的影响见表5。

图2 果蝇攀爬实验折线图Fig.2 Climbing ability in drosophila following pine supplement

表5 松针粉对果蝇体内含水量的影响（n=4）Table 5 Detection of water content in drosophila in each group（n=4）

与空白对照组相比，高剂量组体内水分含量无显著性差异；中剂量组呈现极显著差异（P<0.01）；低剂量组雄果蝇与对照组相比，有显著性差异（P<0.05）；研究发现各组雌果蝇的体内含水量明显高于雄果蝇。

3.2.5 松针粉对果蝇繁殖能力的影响

松针粉对果蝇繁殖能力的影响见图3。

图3 不同日龄果蝇繁殖果蝇数统计Fig.3 Reproduction parameters in drosophila following pine supplement

与空白对照组相比，各阶段高剂量组果蝇子代个数减少，中剂量组果蝇子代数增加（P<0.05或P<0.01），低剂量组30 d果蝇的子代数有显著差异（P<0.01）。值得注意的是，随着日龄增加对照组果蝇子代数呈降低趋势，而终生补充低剂量松针粉的果蝇随着日龄增加，果蝇子代数呈上升趋势，尤以30日龄的果蝇产的子代数最多，可见终生低剂量补充松针粉可大大提高老年时期生物的繁殖能力，功效明显。

4 讨论

清除自由基延缓衰老[10]的学说被越来越多人认可，衰老过程中自由基促成的脂质过氧化作用亦随龄增高[11]，SOD是存在于生物体内的抗氧化酶系，能有效地清除细胞代谢过程中产生的氧自由基[12]，GSH可以认为是生物体内氧自由基消除系统的重要防线，主要起保护细胞膜结构和功能的作用[13]。细胞中的脂类物质受到氧自由基作用时，发生脂质过氧化反应，产生一些分解产物如MDA等。MDA作为机体脂质过氧化反应的最终代谢产物，其高低又间接反应了机体细胞受自由基攻击的严重程度[14-15]。

检测动物的寿命是目前研究老龄化和抗老龄化中应用普通、较有权威的试验手段之一，果蝇这种模式生物[16]用于寿命实验的先进性和机理探讨的优势较为明显，其优点在于生命周期短、繁殖力强[17]，遗传背景清晰又具有相对简单的脑[18]，有方便的遗传学工具[19]，且基因组小[20]，易于分析操作。

小鼠抗氧化实验中老年给药组与老年模型组相比，MDA含量略降低，SOD、GSH含量明显升高，说明松针粉对老龄小鼠有一定的抗氧化效果。影响果蝇寿命存在多种因素[21-22]，在尽可能保证外界因素一致的情况下进行果蝇寿命实验，结果发现松针可显著性延长各个给药浓度的雌雄果蝇寿命。大量文献已报道松针具有体外抗氧化能力[23-25]，在果蝇培养基中添加不同浓度松针粉喂养30 d后，进行氧化损伤实验中，随着药物浓度的增加与果蝇平均存活时间成正相关，说明松针不仅在体外有一定的抗氧化作用，而且在动物体内也有显著的抗亚急性氧化损伤效果。运动和衰老息息相关[26]，利用正常果蝇具有反趋地性行为的特性进行攀爬测试[27]，松针粉可以提高和改善老年果蝇的攀爬运动能力，增加老年果蝇体内含水量，改善果蝇物质代谢与能量代谢。中、低浓度的松针粉还可增加果蝇的子代数，这些实验说明松针粉可通过提高机体抗氧化能力而抗衰老，其机理可能与其提高抗氧化酶的活性及其抑制脂质过氧化物的产生等一系列抗氧化作用密切相关。其分子机制有待深入研究，它必将在如今老龄化社会发挥更大作用。