qPCR揭示丙酸降解菌群随OLR提高的演替规律

张立国,李彦霖,班巧英*,李建政



qPCR揭示丙酸降解菌群随OLR提高的演替规律

张立国1,李彦霖1,班巧英1*,李建政2

(1.山西大学环境与资源学院,山西 太原 030006；2.哈尔滨工业大学市政与环境工程学院,黑龙江 哈尔滨 150090)

为探讨有机负荷率(OLR)对升流式厌氧污泥床(UASB)反应器运行效能的影响及互营丙酸降解菌群的响应,以稀释的制糖废水为底物,考察了OLR升高对UASB处理效能的影响,并采用实时荧光定量PCR技术(qPCR)分析了互营丙酸降解菌群随OLR提高的演替规律.结果表明,在OLR为6.0~54.0kgCOD/(m3·d)的范围内,UASB处理制糖废水取得了良好的效果,其COD去除率为92.0%以上.qPCR检测结果表明,至少有3种已鉴定的丙酸氧化菌(,和)存在于UASB反应器中.其中,是主要的丙酸氧化菌,其数量为126~1.2×10316S rRNA 基因拷贝数/ng DNA,约占检测到丙酸氧化菌总数的47.9%~58.6%. OLR从6.0提高至54.0kgCOD/(m3·d)导致所有丙酸氧化菌数量显著减少和是该UASB系统中的主要氢营养型产甲烷菌和乙酸营养型产甲烷菌.与丙酸氧化菌的变化趋势相反,这两种产甲烷菌的数量均随OLR的提高而显著增加,并在OLR54.0kgCOD/(m3·d)条件下达到最大值.

升流式厌氧污泥床；有机负荷率；丙酸氧化菌；产甲烷菌；荧光定量PCR

厌氧生物处理技术广泛用于处理各种有机废弃物,同时回收甲烷作为清洁能源[1-3].有机物的厌氧生物处理过程包括4个步骤:水解发酵、产氢产乙酸、同型产乙酸和产甲烷作用.这4个步骤的代谢平衡是保证厌氧反应器高效运行的关键因素[4].然而,当系统遭受温度、有机负荷率、毒性物质等冲击时,以上4个步骤将变得不平衡,从而导致挥发酸大量积累,进而使得系统运行失败[5-6].在这些积累的挥发酸中,丙酸通常占有较大比重,主要是由于丙酸的厌氧降解是一个高度吸能的过程,很难自发进行.此外,丙酸降解还需要产甲烷菌或其他耗氢菌的协同作用,所以其伴生菌的活性和数量对丙酸降解也有一定影响.

在产甲烷环境中,丙酸的降解是通过丙酸氧化菌和产甲烷菌的互营协作来完成的,其在有机物厌氧降解过程中起着重要的作用[7].一方面丙酸氧化菌将丙酸转化为乙酸和H2/CO2,为产甲烷菌提供底物;另一方面产甲烷菌通过消耗乙酸和H2/CO2,为丙酸氧化菌解除产物的反馈抑制作用,同时为丙酸氧化菌提供能量.丙酸氧化菌的这种代谢方式使其分离培养十分困难,导致只有少数丙酸氧化菌被分离和鉴定[5].从系统发育关系看,已鉴定的丙酸氧化菌主要分布在变形菌门(Proteobacteria)的属和属中,以及厚壁菌门(Firmicutes)中低G+C含量、革兰氏阳性菌的属和属中[5].丙酸氧化菌存在于各种厌氧生境中[8-10].它们的组成和分布受到诸多因素的影响,包括丙酸浓度,温度,pH值等[11-13].

尽管关于丙酸氧化菌定性和定量分析的研究已有报道.然而,不同运行条件下互营丙酸氧化菌群定量分析的相关报道仍然较少.前期研究发现,在处理制糖废水的UASB反应器中,和是主要的丙酸氧化菌,而和是主要的产甲烷菌[14].因此,本研究针对这4个属中已鉴定的丙酸氧化菌和产甲烷菌,采用实时荧光定量PCR技术(qPCR)分析其随有机负荷率(OLR)提高的演替规律,为强化反应器运行效能及稳定性提供理论基础.

1 材料与方法

1.1 反应器运行控制

试验装置为UASB反应器,其有效容积为11L.试验废水为稀释的制糖废水,添加尿素和KH2PO4使得废水的COD:N:P为200~300:5:1,并补充微生物生长所必须的微量元素及维生素等[15].在温度(35±1)℃,水力停留时间(HRT)24h,进水COD为1000mg/L, pH值为6.8~7.2条件下启动UASB反应器,然后将UASB的HRT逐渐缩短至8h.待运行稳定后,保持HRT为8h,将进水COD逐渐增加至 2000,4000,8000,12000, 18000mg/L,使得反应器的OLR分别为6.0(15d)、12.0(13d),24.0(19d),36.0(21d),54.0kg/(m3·d)(31d).每次改变OLR均在前一次运行达到稳定时进行.每次运行达到稳定后从污泥床取样,保存至-20℃备用.

1.2 分析项目及方法

pH值和生物量采用标准方法测定[16],产气量通过湿式气体流量计(LML-1,长春汽车滤清器有限责任公司)测定,气体组成和挥发酸组成采用气相色谱仪测定(SP-6800A和SP6890,山东鲁南瑞虹化工仪器有限公司).

1.3 DNA提取及qPCR

称取0.15g污泥(湿重),采用DNA提取试剂盒(MO Bio Laboratories,Inc,Carlsbad,CA,USA)提取厌氧活性污泥总DNA.DNA浓度用分光光度计测定(Thermo Fisher Scientific Inc.USA).

根据和中已鉴定物种的16S rRNA基因序列设计特异引物,引物序列见表1[13].qPCR分析采用绝对定量方式.标准样品为包含目的基因片段融合质粒,用超纯水进行10倍梯度稀释(101~107).标准样品和待测样品同时进行qPCR分析. qPCR在荧光定量PCR系统(7500型, ABI, USA)中完成.所用荧光染料为SYBR green I.反应体系为: SYBR Green PCR Master Mix (Toyobo Co.,LTD., Japan)10μL,DNA样品3μL,引物各1μL, ROX 0.04μL, 4.96μL H2O.反应程序: 94℃预变性1min,94℃ 15s, 58℃30s,72℃ 35s,40循环.每个样品设置3个重复.以达到对数增长时的循环数(C值)为横坐标,标准质粒数目的对数值为纵坐标绘制标准曲线(图1).

表1 qPCR中所用引物序列

图1 qPCR中丙酸氧化菌和产甲烷菌标准曲线

2 结果与讨论

2.1 UASB运行效能

在35℃、HRT8h条件下,考察了OLR提高对UASB反应器运行效能的影响.结果表明,在OLR为6.0~54.0kgCOD/(m3·d) 条件下,COD去除率高达92.0%以上(表2).当OLR分阶段从6.0逐渐提高至54.0kgCOD/ (m3·d)时,出水挥发酸浓度提高了0.6~3.8倍.当OLR为6.0kgCOD/(m3·d)时,出水中乙酸和丙酸含量相当,分别为47.5,46.0mg/L.然而,有机负荷率的提高使得丙酸含量在总挥发酸中比例提高到55.2%~ 62.4%之间.随着有机负荷率的不断提升,UASB的生物量和比产甲烷速率也逐渐增加.以前的研究表明,当UASB处理水葫芦汁液和乙酰氨基苯璜酰氯(p-ASC)生产废水时的最佳OLR分别为8.9,7.0kgCOD/ (m3·d),其COD去除率可达到86.6%和100%[17-18].

表2 不同OLR条件下UASB反应器运行特征

2.2 丙酸氧化菌的qPCR分析

厌氧生物处理反应器的运行效能与系统中的微生物群落结构密切相关.前期研究发现该UASB中的主要丙酸氧化菌在分类学上属于属和属[14].因此,本研究针对上述2个属中已鉴定的丙酸氧化菌,通过qPCR探讨了UASB反应器在OLR为6.0,12.0,24.0,36.0, 54.0kgCOD/(m3·d)条件下丙酸氧化菌的数量.结果表明,有3种已鉴定丙酸氧化菌存在于所有检测的样品中,分别是、和(图2)其中,和是2个专性互营菌,只有与产甲烷菌共培养时才能生长[5].而除了能与产甲烷菌共培养外,还能在一些简单底物上进行纯培养[5].它们通过甲基丙二酰-辅酶A途径(MMC)降解丙酸[19-21].

图2 不同OLR条件下丙酸氧化菌定量分析

丙酸氧化菌的qPCR分析表明,当OLR为6.0kgCOD/(m3·d)时,、和的含量分别为:355,681,1.2×103个16S rRNA 基因拷贝数/ng DNA.和是该条件下的主要丙酸氧化菌,二者总数为1.9×10316S rRNA基因拷贝数/ng DNA,占检测到丙酸氧化菌总数的84.3%(图2和图3).由图2可知,随着OLR分阶段提高至54.0kgCOD/ (m3·d),所有检测到丙酸氧化菌的数量逐渐减少.但是从表2可以看出,出水丙酸发生了一定程度的积累,但并不显著.分析认为,这可能是由于产酸发酵阶段没有产生大量的丙酸,使得丙酸氧化菌可利用的底物减少,进而导致丙酸氧化菌数量的减少.

图3 不同OLR条件下丙酸氧化菌的相对丰度

另外,本研究发现,在OLR 6.0~54.0kgCOD/ (m3·d)条件下,是UASB反应器中的优势丙酸氧化菌,其相对丰度为47.9%~58.6%.类似地,也有研究发现,在处理全脂奶粉、蔗糖、混合酸(丁酸、丙酸、乙酸)废水时,或是优势丙酸氧化菌[10-11].然而,Shigematsu等的研究发现,在一个以丙酸为唯一碳源的恒化器中,高稀释率促进生长,而低稀释率有利于的生长[22].

2.3 产甲烷菌的qPCR分析

作为有机物厌氧消化的最后一步,高效的产甲烷作用对于维持厌氧消化系统的效能是至关重要的.因此,本研究也考察了不同OLR条件下产甲烷菌的数量.如图4所示,本研究检测到两种产甲烷菌,它们是和为氢营养型产甲烷菌,可利用H2/CO2和甲酸进行生长代谢[23].而只能利用乙酸进行生长代谢、产甲烷,它可以利用浓度低至5~20μmol/L的乙酸[21].以前的研究表明,在含有颗粒污泥反应器中,是主要的乙酸营养型产甲烷菌,它们能够促进污泥颗粒化[23-25].

qPCR分析表明,两种产甲烷菌的数量均随OLR的提高而显著增加.在OLR为6.0kgCOD/(m3·d)条件下,的数量仅为889个16S rRNA 基因拷贝数/ng DNA.当OLR分阶段提高至12.0,24.0,36.0, 54.0kgCOD/(m3·d)时,的数量增加了3.3~ 101倍,并在最后一个运行阶段达到最大值(9.1×104个16S rRNA基因拷贝数/ng DNA).类似地,的数量也随OLR的提高而不断增加.在OLR为6.0,12.0,24.0,36.0,54.0kgCOD/(m3·d)条件下,的数量分别为2.6×104,1.9×105,5.0×105, 7.5×105,1.8×106个16S rRNA基因拷贝数/ng DNA.乙酸营养型产甲烷菌数量的增加使得该反应器出水乙酸浓度低于150mg/L(表2).产甲烷菌数量的增加主要是由于产甲烷菌的底物随有机负荷率不断提高而增加所致.

尽管氢营养型产甲烷菌和乙酸营养型产甲烷菌的数量表现出了相同的变化趋势,但是后者的数量总是比前者高出2个数量级,说明乙酸裂解可能是该系统中主要的产甲烷途径.以前的研究也表明,大约2/3的甲烷来自乙酸途径[21].另外,本研究还发现,当OLR£24.0kgCOD/(m3·d)时,乙酸营养型产甲烷菌的增加幅度高于氢营养型产甲烷菌,其相对丰度从96.7%增加至99.2%.但继续提高负荷导致乙酸营养型产甲烷菌的相对丰度从99.2%降低至95.1%,说明较高的负荷(³36.0kgCOD/(m3·d))对乙酸营养型产甲烷菌的生长产生了一定程度的抑制.研究还表明,高浓度氨氮(³3.5g/L)可对乙酸营养型产甲烷路径产生显著的抑制作用[26-27].本研究中,UASB反应器中的氨氮浓度总是低于100mg/L,所以并没有抑制产甲烷作用.

以上结果表明,OLR提高并没有使丙酸氧化菌和产甲烷菌的组成发生改变,但却导致它们的数量发生了明显变化.丙酸氧化菌的数量随OLR的提高而降低,而产甲烷菌的数量却随OLR的提高而增加.

3 结论

3.1 在35℃、HRT8h条件下,当OLR从6.0kgCOD/ (m3·d)分阶段提高至54.0kgCOD/(m3·d)时,UASB系统的COD去除率高达92.0%以上,比产甲烷速率从130.5LCH4/(kg COD·d)增加至827.6LCH4/(kg COD·d).

3.2 在OLR 6.0kgCOD/(m3·d)条件下,、和的数量分别为:355、681和1.2×103个16S rRNA 基因拷贝数/ng DNA.它们的数量随OLR的提高而逐渐减少,这可能是由于产酸发酵阶段的发酵类型改变而导致的.

3.3 随着OLR逐渐提高,产甲烷菌的数量显著增加.在OLR为54.0kgCOD/(m3·d)条件下,和的数量达到最大值,分别为:9.1×104和1.8×106个16S rRNA基因拷贝数/ng DNA.

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qPCR reveals the succession of syntrophic propionate-degrading consortia with OLR increase.

ZHANG Li-guo1, LI Yan-lin1, BAN Qiao-ying1*, LI Jian-zheng2

(1.College of Environment and Resource, Shanxi University, Taiyuan 030006, China；2.School of Municipal and Environmental Engineering, Harbin Institute of Technology, Harbin 150090, China)., 2018,38(8)：2997~3002

To reveal the effects of organic loading rate (OLR) on the performance of upflow anaerobic sludge bed (UASB) reactor and syntrophic propionate-degrading consortia, this study investigated the effects of OLR increase on the treatment efficiency of UASB containing sugar refinery wastewater as substrate. The succession of syntrophic propionate-degrading consortia as OLR increasing was analyzed by quantitative real-time fluorescence polymerase chain reaction (qPCR). The results showed that the COD removal reached above 92.0% in UASB at OLR of 6.0~54.0kgCOD/(m3·d) conditions. qPCR explored that at least three identified species of propionate-oxidizing bacteria (,, and) existed in the UASB system.was dominated in UASB and its quantity was 126~1.2×10316S rDNA copies per ng DNA, accounting for 47.9%~58.6% of the total detectable propionate-oxidizing bacteria. OLR increase from 6.0 to 54.0kgCOD/(m3·d) resulted in all detected propionate-oxidizing bacteria significantly decreased. In addition,andwere the dominant hydrogenotrophic methanogens and acetotrophic methanogens. The number of methanogens was significantly increased with OLR increase and achieved a maximum at OLR of 54.0kgCOD/(m3·d) condition.

upflow anaerobic sludge bed；organic loading rate；propionate-oxidizing bacteria；methnaogens；qPCR

X703.5

A

1000-6923(2018)08-2997-06

张立国(1980-),男,河南安阳人,副教授,博士,主要从事废水厌氧生物处理研究.发表论文20余篇.

2018-01-18

国家自然科学基金(51708341);山西省“青年三晋学者”支持计划;山西省高等学校优秀创新团队支持计划

* 责任作者, 讲师, banqiaoying@163.com