阿魏酸酯酶酶化发酵饲料饲喂三元猪的影响

罗 云，王镇发，梅 胜，陈培钦，李夏兰*

（1.华侨大学 化工学院，福建 厦门 361021；2.漳州市龙文区环境保护监测站，福建 漳州363005）

阿魏酸酯酶 （EC 1.1.73，feruloyl esterase，FAE）是降解木质纤维的关键酶之一，阿魏酸酯酶在饲料中的应用引起了广泛关注。李夏兰等[1]研究发现在降解木质纤维时，FAE和木聚糖酶存在协同作用，将麦糟中阿魏酸 （4-羟基-3-甲氧基肉桂酸，ferulic acid，FA）的释放量提高到 0.97 mg/g（干麦糟），低聚木糖（xylooligosaccharides，XOS）的释放量达到 161 mg/g（干麦糟）。据报道，FAE产生菌与纤维素酶共同添加到青贮饲料中，对青贮饲料的有氧稳定性、纤维素降解率，饲料营养价值以及动物的生产性能和消化性能都会产生积极影响[2-5]。但是大多数直接添加FAE产生菌到青贮饲料的作用效果不稳定，对部分营养价值的影响不显著。杨道秀等[6]和王林林等[7-8]将FAE粗酶液直接添加到鸡饲料中发酵，酶化发酵饲料的营养价值、对肉鸡的生产性能和消化性能都有显著影响。鉴于直接添加FAE产生菌对青贮饲料效果的不稳定性，以及肉鸡采食量小，肠道较短，不能充分体现FAE酶化发酵饲料对大型单胃动物生产性能和消化性能的影响，本试验将FAE与含乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌等的饲料发酵剂共同作用，探究FAE对饲料的营养价值的影响，以及对三元猪的生产性能、消化性能和经济效益的影响。

1 材料与方法

1.1 试验设计

漳州市南靖县靖城镇养殖场进行125 d喂养试验，选用 81头公母对半、出生日龄（80±2）d、体质量15～18 kg的健康（杜×长×大）三元杂交断奶仔猪，随机分成A、B、C 3组，每组3个平行，每个平行9头。A组为基础饲粮组，饲喂普通饲料；B组为发酵饲料组，饲喂混有质量分数12%例发酵饲料的基础饲粮；C组为酶化发酵饲料组，饲喂含有质量分数12%酶化发酵饲料的基础饲粮。饲养期间密切注意猪的精神状态、进食量与速度、腹泻头数和次数、生病头数与次数，记录猪的采食量。试验期间每天08：00和16：00各饲喂1次，饲料计量不限重，以食槽无剩余料为原则。保证充足的清洁饮水，对猪舍每天打扫2次，按常规饲养和免疫，全程无使用抗生素药物。

基础饲粮配方及营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平（风干基础）Table 1 Composition and nutrient levels of basal diet（air-dry basis） %

1.2 试验材料

1.2.1 主要仪器 超滤膜装置（截留相对分子质量10×103），上海摩速科学器材有限公司产品；发酵袋，顺德沃进塑料制品厂制造；1100高效液相色谱仪，美国Agilant公司产品；HPX-42A柱，美国Bio-Rad公司产品；ODS-C18柱，美国Thermo公司产品；UV-6100紫外可见光分光光度计，上海美谱达仪器有限公司产品；2.5-12A马弗炉，浙江杭州蓝天化验仪器厂制造。

1.2.2 主要原料 反式阿魏酸标准样品，美国Sigma公司产品；阿魏酸甲酯标准样品，Alfa Aesar公司产品；XOS标准品、木二糖标准品，日本和光纯药工业株式会社产品；总氨基酸测定试剂盒、乳酸测定盒试剂盒，南京建成生物工程研究所提供；麸皮、次粉，中粮集团厦门海嘉面粉有限公司产品；玉米蛋白饲料，山东滨州海星饲料厂制造；瓜尔豆粕，广饶六合化工有限公司产品；棕榈仁粕，大连镁达国际贸易有限公司产品；预混料，厦门百穗行科技有限公司产品；发酵剂1×1010 CFU/g，山东宝来利来生物工程公司产品；杏鲍菇菌柄，福建嘉胜集团大建饲料有限公司产品。

1.3 发酵饲料制备

1.3.1 FAE粗酶液的制备 菌种：黑曲霉，实验室自行筛选并保藏。

种子培养基：PDA培养基，36℃，200 r/min培养2 d。

发酵培养基：麸皮与次粉1∶1混合物质量分数39.30%，水质量分数58.20%，硫酸镁质量分数0.06%，硫酸铵质量分数2.44%。采用白瓷盘固体发酵，33℃培养6 d。

粗酶液的制备：固体发酵料中加入8倍体积的蒸馏水，33℃，180 r/min抽提2.5 h，用8层纱布过滤，滤液超滤浓缩。

1.3.2 发酵饲料和酶化发酵饲料的制备 饲料配方（以干物质计，质量分数）：玉米蛋白饲料26%，菌柄12%，谷壳粉16%，棕榈仁粕11%，瓜尔豆粕5%，玉米粉5%，糖蜜0.3%，发酵剂0.1%，水24.7%。

发酵饲料的制备：按质量分数0.1%的比例将发酵剂菌种加入饲料配方中，充分混匀，采用带有单向排气阀的饲料发酵袋进行常温发酵。每袋装料量为40 kg，1个月后鉴定其营养品质。

酶化发酵饲料的制备：按8 U/g干菌柄将FAE添加于饲料原料中（酶液所占质量从水中扣除），再加入质量分数0.1%发酵剂，充分混匀，采用带有单向排气阀的发酵袋常温发酵。每袋装料量为40 kg，发酵1个月后鉴定其营养品质。

1.4 饲料和粪便中指标测定

1.4.1 饲料和粪便中常规指标测定 粗蛋白质含量按 《GB/T 6432-1994饲料中粗蛋白质测定方法》分析[9]；粗纤维含量按《GBT-6434-2006饲料中粗纤维测定方法》分析[10]；中性洗涤纤维（neutral detergent fiber，NDF）含量按《GB/T 20806-2006 饲料中中性洗涤纤维的测定》分析[11]；酸性洗涤纤维（acid detergent fiber，ADF）含量按《NY/T 1459-2007饲料中酸性洗涤纤维的测定》分析[12]；酸性洗涤木质素（acid detergent lignin，ADL）含量按《GB/T 20805-2006饲料中酸性洗涤木质素的测定》分析[13]；总糖含量按 《GB/T 15672-2009食用菌中总糖含量的测定》分析[14]。

1.4.2 FA、XOS、总氨基酸和乳酸测定 总氨基酸含量试剂盒测定，原理为铜离子与氨基酸的显色反应；乳酸含量采用试剂盒测定，原理为乳酸脱氢酶的显色反应。按文献[1]的方法检测FA和XOS，FA含量测定采用HPLC法：色谱柱为ODS-C18柱，318 nm检测，柱温35℃，流动相为甲醇∶水∶冰醋酸=30∶69.5∶0.5（V/V/V），流速为 1 mL/min，XOS 含量测定采用HPLC法：色谱柱为Aminex HPX-42A柱，柱温85℃，示差折光检测器，流动相为超纯水（超声波脱气 1 h），流速 0.6 mL/min。

1.4.3 总菌数和乳酸菌数测定 细菌总数按《GB/T 13093-2006饲料中细菌总数的测定》分析[15]；乳酸菌总数按 《GB 4789.35-2010食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》分析[16]。

1.4.4 饲料卫生检测和猪肉品质检测 饲料和猪肉送至福建省分析检测中心。饲料样品按《GB 13078-2001饲料卫生标准》分析[17]，猪肉样品按《GB 2707-2005《鲜（冻）畜肉卫生标准》分析[18]。

1.5 三元猪测试指标及测定方法

平均日增重：以头为单位分别称取试验期间试验猪的始重和末重，称重前10 h禁食，计算平均日增重；平均日采食量：记录各组每天的投料量，观察试验猪采食情况，计算平均日采食量；腹泻率：观察和记录各组试验猪的腹泻头数和天数。

其中，I为腹泻率；N为腹泻头数；M为腹泻天数；N0为总头数；M0为总天数。

腹泻评分标准见表2[19]。

表2 腹泻评分标准Table 2 Grading criteria of diarrhea

粪便收集：当猪生长到育肥期时，进行10 d的粪便采集。前7 d为预试期，后3 d为收粪期。从第8 天开始，每日 06：30～08：30 和 16：30～18：30，将各栏内粪便混匀，取1 000 g粪便样品，加入100 mL质量分数10%的HCl，混匀后于-20℃冰箱中保存。第10天将各栏3 d粪便混合，待测；消化率测定：采用盐酸不溶性灰分（ash insoluble hydrochloric acid，AIA）为内源性指示剂，计算各组粗蛋白质、NDF、ADF、ADL、干物质、粗灰分的消化率；饲料报酬：记录试验期内各组饲料的总耗量、饲料费用、猪的总增重，计算饲料报酬。

1.6 数据统计分析

数据采用SPSS 19.0软件的ANOVA进行方差分析，Duncan法进行多重比较，各组数据以平均值±标准差（mean±SE）表示。

2 结果与分析

2.1 FAE对饲料品质的影响

2.1.1 FAE对饲料感官品质的影响 酶化发酵饲料为棕黄色，具有芳香的酒糟味，酸味浓而不刺鼻，给人以舒适的嗅感，手摸后味道容易洗掉；袋内压得非常紧密，拿到手上较松散、略湿润、清爽；饲料颗粒均匀。发酵饲料所产生的酸味很浓烈，但不刺鼻，香味淡，呈金黄色；袋内压得紧密，拿到手上松散，手感略显粗糙；饲料颗粒均匀。酶化发酵饲料因加入了黑曲霉固态发酵得到的粗酶液，使其饲料颜色略深，且酵化发酵饲料明显更具芳香味。发酵饲料所测定的易挥发性物质和水分质量分数为33.17%，比酶化发酵饲料易挥发性物质与水分质量分数低12.17%，使得发酵饲料手感略粗糙，不够柔软。

表3 FAE对饲料感官品质的影响Table 3 Effects of FAE on sensory quality of feed（n=3）

2.1.2 FAE对饲料组成的影响 由表4可知，酶化发酵饲料与发酵饲料相比，ADF与NDF的降解率分别提高了5.13%、25.31%，具有显著差异 （P＜0.05）；酶化发酵饲料中总氨基酸、FA和XOS的质量分数分别比发酵饲料提高了1.71、2.33和1.88倍，具有显著差异（P＜0.05）；单位饲料中细菌总数、乳酸菌总数的含量大大提高，分别提高了104倍和103倍，具有显著差异（P＜0.05）。这是由于FAE可以与枯草芽孢杆菌代谢产生的木聚糖酶协同作用，降解木质纤维中的碳骨架，使酶化发酵饲料中的纤维降解率提高，释放了XOS和FA，XOS有利于益生菌的增殖，且代谢过程中不断增加的游离氨基酸、小分子肽等物质也可以有效促进有益菌的繁殖。酶化发酵饲料中细菌总数与乳酸菌总数的含量显著高于发酵饲料（P＜0.05），但是乳酸菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌等有益菌大量繁殖的同时并没有降低饲料中总糖的含量。但发酵饲料中乳酸质量分数（6.21 mg/g）高于酶化发酵饲料中乳酸质量分数（3.99 mg/g），具有显著差异（P＜0.05）；发酵饲料 pH 4.11与酶化发酵饲料pH 4.27也具有显著差异 （P＜0.05）。

表4 FAE对饲料组成的影响Table 4 Effects of FAE on feed composition（n=3）

2.1.3 饲料卫生指标检测 经检测，酶化发酵饲料的各项卫生指标如表5所示，均符合 《GB 13078-2001饲料卫生标准》要求。

2.2 酶化发酵饲料对三元猪腹泻率的影响

在试验全程中，按照常规免疫，未添加任何抗生素及其他药物，各组试验猪的成活率100%，C组的腹泻率比A组和B组分别低0.35%和0.21%，差异显著（P<0.05），见表6。

表5 酶化发酵饲料卫生检测报告Table 5 Hygiene inspection report of enzymatic fermentad feed

表6 FAE对三元猪腹泻率的影响Table 6 Effect of FAE on the diarrhea rate of pigs

2.3 酶化发酵饲料对三元猪生产性能的影响

由表7可知，与A组和B组相比，C组的平均日采食量分别提高了41.10%和15.73%，差异显著（P<0.05）。C组的平均日增重与A组和B组相比分别提高了26.15%和17.14%，差异显著（P<0.05）。与A组比较，B组的平均日采食量提高了21.92%，差异显著（P<0.05）。与A组比较，C组和B组的料重比分别提高了11.56%和12.89%，差异显著（P<0.05）。

表7 FAE对三元猪生产性能的影响Table 7 Effects of FAE on pig's growing performance

2.4 酶化发酵饲料对三元猪表观消化率的影响

饲料表观消化率的测定采用AIA为内源性指示剂，其回收率为102.15。由表8可知，与A组比较，B组和C组对干物质的利用率分别提高了0.31%和 0.35%，差异显著（P<0.05）；与 A 组比较，B组和C组对NDF的消化率分别提高了9.39%和10.34%，差异显著（P<0.05）；对于 ADF 的消化率，B组和C组比A组分别提高了60.59%和79.95%，差异极显著（P＜0.01）；对于粗灰分的消化率，B组和C组与A组相比分别提高了12.65%和20.61%，差异显著（P＜0.05）。C组与B组相比，对粗灰分的消化率提高了7.06%，具有显著差异（P＜0.05）。B组和C组对三元猪纤维素和干物质的消化率作用不显著，可能是由于在饲料贮存和发酵过程中已降解了一部分纤维素，同时猪的胃肠中缺少能够进一步协同降解木质纤维的其他酶类。

2.5 酶化发酵饲料报酬分析

由于发酵饲料中添加了饲料发酵剂，其饲料价格比基础饲粮组增加了6.82%，酶化发酵饲料中添加了饲料发酵剂和FAE粗酶液，其饲料价格比基础饲粮组增加了15.91%。试验期间，C组平均每头猪的饲料费用、重质量和毛利比A组分别增加了63.54%、26.15%和 6.62%，具有显著差异（P＜0.05）。从表9可知，C组虽然提高饲料的料重比，但其通过改善饲料的风味，提高饲料的适口性，增加其采食量和日增重，从而可缩短饲喂周期，提高经济效益。

2.6 猪肉安全检测

经检测，饲喂酶化发酵饲料猪的鲜肉卫生指标如表10所示，均符合《GB 2707-2005《鲜（冻）畜肉卫生标准》要求。

表8 FAE饲料对养分表观消化率的影响Table 8 Effects of FAE on nutrient apparent digestibility %（质量分数）

表9 饲料报酬分析Table 9 Remuneration analysis of feed

表10 饲喂酶化发酵饲料猪的鲜肉卫生检测报告Table 10 Hygiene inspection report of pig meat feeding enzymatic fermentrd feed

3 讨论

3.1 FAE与发酵剂的相互作用及其对饲料发酵的影响

酶化发酵饲料采用了黑曲霉固态发酵得到的FAE粗酶液与微生态发酵剂共同作用，其中发酵菌株主要有枯草芽孢杆菌、酵母菌、乳酸杆菌。在酶化发酵饲料中FAE和发酵剂中微生物所分泌的木聚糖酶协同作用，提高菌柄中抗营养因子的降解效率，同时产生FA和XOS。随着微生物菌群的大量繁殖，与发酵饲料相比，微生物所分泌的酶也相对增加，饲料中蛋白质、纤维素、糖类等大分子物质降解率也相对提高，同时一些寡糖、小分子肽、有机酸等不断积累。XOS功能性小分子物质能够调节肠道菌群平衡，促进发酵菌群的生长，促进畜禽生长等作用，在一定程度上替代了饲用抗生素的作用[20]。

3.2 FAE酶化发酵饲料对三元猪生产性能的影响

所研制的FAE酶化发酵饲料，提高了饲料风味，改善适口性，促进畜禽采食，增强生产性能。这是因为：一是发酵饲料中有大量益生菌且产生的XOS增殖益生菌，可以竞争性抑制畜禽肠道中有害菌定植；二是实验观察到，酶化发酵饲料明显更具芳香味，这是饲料中的微生物可能将释放的FA转化成香草酸和香草醛等饲料风味物质[21-22]。

此类芳香类物质，更明显提高饲料风味，改善适口性，促进畜禽采食，增强生产性能。本试验结果表明，FAE酶化发酵饲料可以显著提高三元猪的平均日增重和平均采食量。Salem等[23-25]提到添加培养基中的代谢活性成分，酶制剂和微生物发酵剂可以改善饲料的风味，增加采食量，提高饲料营养价值，促进畜禽的生长性能和消化性能。王林林等[8]用阿魏酸酯酶酶化发酵饲料饲喂肉鸡，肉鸡的日增重提高了6.42%，料重比降低了11.34%。此外，酶化发酵饲料组降低了腹泻率，从而也提高了经济效益。Marla等[26]研究发现用含FAE酶活的奶酪饲喂老鼠，可以提高老鼠肠道中FAE酶活，降低血浆中硫代巴比妥酸反应物质，提高谷胱甘肽还原酶活性，有助于提高动物的氧化应激性，防止氧化应激相关障碍。

3.3 FAE酶化发酵饲料对三元猪消化性能的影响

饲料转化率越好，表明试验动物对饲料中营养物质的消化吸收好。本试验中，与基础饲粮的高能量饲粮相比，发酵饲料和酶化发酵饲料的高纤维增强了畜禽肠道蠕动，缩短了饲料在胃肠中的保留时间，使得饲料转化率低于基础饲粮组。Strube等[27]提到提高饲料中纤维素含量和饲喂频率，可以缩短饲料在猪肠胃中的保留时间。酶化发酵饲料组与发酵饲料组相比，干物质的消化率有显著提高，对粗蛋白质、半纤维素的消化率有提高趋势。这表明FAE酶化发酵饲料对三元猪干物质、粗蛋白质和半纤维素消化、吸收起到了促进作用。

4 结 语

FAE与微生物饲料发酵剂共同发酵可以促进饲料中益生菌的生长，协同降解纤维素，增加饲料中FA、XOS等益生元质量分数，提高饲料的营养价值。在三元猪饲料中添加酶化发酵饲料，可以显著提高三元猪的平均日采食量和平均日增重，缩短饲喂周期，在一定程度上提高了饲料的消化率，增加三元猪养殖的经济效益。