人参皂苷Rg1对过氧化损伤人脐带间充质干细胞的保护作用及机制

种宗雷,杨晓倩,肖以磊,吕甲涛,侯磊,许鹏,朱伟杰

(1 聊城市人民医院脑科医院，山东聊城252000；2济南军区总医院)

干细胞移植是治疗脊髓损伤等神经损伤性疾病的研究热点，而移植入的干细胞异常衰老[1]一直是影响移植治疗效果的难题。研究发现，脊髓损伤伴随脊髓水肿进一步减少血流[2]，脊髓损伤微环境中自由基介导的脂质过氧化作用造成神经结构和功能的严重损伤，甚至使神经功能永久性丧失[3]。自由基作用于脂质发生过氧化反应，会损伤植入的干细胞[4，5]。2012年12月～2018年4月，本研究通过观察人参皂苷Rg1对过氧化损伤人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)形态、增殖、衰老、细胞因子分泌、胞内蛋白质表达的影响，探讨Rg1对hUCMSCs有无保护作用及可能的作用机制，以提高干细胞对神经损伤的治疗效果。

1 材料与方法

1.1 材料 hUCMSCs由聊城市人民医院中心实验室提供。人参皂苷Rg1购自上海雅吉生物科技有限公司，纯度大于95%;人肿瘤坏死因子α(TNF-α)ELISA试剂盒购自上海雅吉生物科技有限公司,β-半乳糖苷酶原位染色试剂盒、CCK-8试剂盒、磷酸-p38分裂原激活的蛋白激酶(p-p38 MAPK)抗体、磷酸化应激活化蛋白激酶(p-JNK/SAPK)抗体、二氨基联苯胺(DAB)辣根过氧化物酶显色试剂盒购自碧云天生物技术研究所。

1.2 hUCMSCs鉴定 采用流式细胞术检测hUCMSCs表面抗原。0.125%胰蛋白酶消化P5代细胞，加入PBS离心后去掉胰蛋白酶，调整细胞浓度达1×109/L以上。将待检细胞样品分装后,阴性对照管加入鼠IgG-FITC、IgG-PE，其他管分别加入鼠抗人CD105-FITC、CD29-PE、CD45-FITC、CD44-FITC、HLA-DR-PE和CD34-PE，各20 μL，室温孵育30 min后，流式细胞仪检测。

1.3 Rg1浓度筛选、细胞分组及处理 采用CCK-8比色法。取生长状态良好的P5～P6代hUCMSCs，分别在不同Rg1浓度(0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256 μmol/L)的培养基中培养66 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μL，培养4 h，用酶标仪在450 nm处测定吸光度。将hUCMSCs分为阴性对照组(以3.3×105个/mL细胞密度接种到含50 ng/mL干细胞生长因子、10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的培养基)，模型组(阴性对照组条件下培养，细胞融合达80%时加入1.6 μmol/L H2O2)，Rg1低、中、高剂量组(模型组条件下培养30 min后，加入Rg1各0.5、4、32 μmol/L，继续培养36 h)，阳性对照组(模型组条件下培养30 min后，加入220 μmol/L维生素C，继续培养36 h)。

1.4 细胞增殖活性的检测 采用CCK-8比色法。96孔板中按分组每孔加入3.3×105/mL细胞悬液200 μL，培养细胞融合至80%时，加入CCK-8溶液20 μL，细胞培养箱内孵育4 h，用酶标仪在450 nm处测定吸光度(OD值)。

1.5 培养上清TNF-α水平检测 采用ELISA法。收集细胞培养上清液，用人TNF-α ELISA试剂盒(上海雅吉生物科技有限公司)检测。将TNF-α标准品加入稀释液150 μL后，加于酶标板孔底部，37 ℃温育30 min，加满洗涤液5次，加入酶标试剂温育、洗涤，加入显色剂，37 ℃避光显色15 min，加终止液，测量各孔的吸光度(OD值)。

1.6 衰老hUCMSCs百分比的检测 采用β-半乳糖苷酶染色法。收集各组细胞，加β-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定10 min，PBS洗涤3次，每次3 min，加入染色工作液，37 ℃孵育20 min或更长时间，直至部分细胞的颜色变蓝。通过400倍油镜显微镜下观察，在三个独立的区域中计数超过400个细胞来计数β-半乳糖苷酶染色阳性细胞。

1.7 hUCMSCs中p-p38蛋白表达检测 采用免疫组化法。各组细胞用固定液固定后，免疫染色洗涤液洗涤两次，滴加封闭液3% H2O2封闭60 min；滴加p-p38 MAPK抗体(1∶500)，37 ℃孵育过夜，PBS冲洗；滴加二抗，37 ℃孵育15 min，PBS冲洗;DAB显色液3～5 min,显微镜下观察，使用Image-Pro Plus 6.0分析各蛋白的积分光密度值。

1.8 hUCMSCs中p-JNK蛋白表达的检测 采用Western blotting法。各组细胞(1×106个)加裂解液100 μL，冰上裂解30 min;细胞置于1.5 mL离心管中，12 000 r/min离心10 min，收集上清；每孔上样蛋白质约40 μg，10% SDS-PAGE电泳，转膜；封闭液室温封闭1 h;分别加入p-JNK的多克隆抗体4 ℃过夜；加入二抗室温孵育1 h;ECL试剂显色，图像分析系统分析各组的积分光密度值。

2 结果

2.1 hUCMSCs的鉴定结果 流式细胞术检测结果显示hUCMSCs高表达CD29、CD44、CD105等间充质细胞标志。

2.2 Rg1对H2O2损伤的hUCMSCs增殖的影响 阴性对照组贴壁细胞明显增大并分裂增殖，呈长梭形，可铺满板底。模型组仅有少量的细胞贴壁生长，边缘圆润。Rg1低剂量组仅有少量的细胞贴壁生长，边缘较圆润。Rg1中剂量组hUCMSCs长梭形。Rg1高剂量组贴壁细胞明显增大并分裂增殖，呈长梭形，可铺满板底。阴性对照组、模型组、Rg1低剂量组、Rg1中剂量组、Rg1高剂量组、阳性对照组OD值分别为0.93±0.09、0.83±0.10、0.85±0.12、0.88±0.11、0.92±0.08、0.91±0.09，与阴性对照组相比，模型组、Rg各剂量组OD值降低(P均<0.05)；与模型组相比，Rg1低、中、高剂量组OD值逐级升高(P均<0.05)；与阳性对照组相比，Rg1高剂量组OD值增加(P<0.05)。与Rg1低、中剂量组比较，阳性对照组OD值升高(P均<0.05)。

2.3 各组p-JNK、p-p38蛋白及TNF-α表达比较 与阴性对照组相比，模型组、Rg1各剂量组p-JNK、p-p38蛋白及TNF-α表达升高(P均<0.05)；与模型组相比，Rg1低、中、高剂量组p-JNK蛋白、p-p38蛋白、TNF-α表达量逐级减小(P均<0.05)；与阳性对照组相比，Rg1高剂量组p-JNK蛋白、p-p38蛋白、TNF-α表达降低(P均<0.05)。与Rg1低、中剂量组比较，阳性对照组p-JNK、p-p38蛋白及TNF-α表达降低(P均<0.05)。见表1。

表1 各组p-JNK、p-p38蛋白及TNF-α表达比较

2.4 各组衰老hUCMSCs百分比比较 阴性对照组、模型组、Rg1低剂量组、Rg1中剂量组、Rg1高剂量组、阳性对照组衰老hUCMSCs百分比分别为6.53%±0.51%、52.10%±4.20%、31.62%±1.87%、22.23%±3.10%、6.12%±0.41%、21.62%±1.57%。与阴性对照组相比，模型组、Rg1各剂量组衰老hUCMSCs百分比升高(P均<0.05)；与模型组相比，Rg1低、中、高剂量组衰老hUCMSCs百分比降低(P均<0.05)；与阳性对照组相比，Rg1高剂量组衰老hUCMSCs百分比减少(P<0.05)。与Rg1低、中剂量组比较，阳性对照组衰老hUCMSCs百分比减少(P均<0.05)。

3 讨论

人参含有多种成分，各成分均有重要作用，如皂苷Rh2、Rg3抗肿瘤作用[6,7]，Rb1可促进荷尔蒙分泌[8]、促进生物合成、增强免疫力、保护细胞、抗疲劳、抗氧化等[8～11]。Rg1对干细胞的作用引起了广泛关注，能够显著提升雪旺细胞等干细胞增殖、再生[12]，能够促进造血干祖细胞增殖[13]等。Rg1抗炎机制与大脑黑多巴胺能神经元的保护密切相关，还能抑制补体诱导的足细胞损伤、细胞衰老、细胞内的活性氧产生，降低p-p38蛋白表达。

脐带MSCs与骨髓、脐血来源的MSCs相似，具有间充质干细胞特征。脐带MSCs具有多向分化潜能，不表达或低表达移植相关的细胞表面标记，免疫原性低，使用不需经过严格配型，同种异体移植无免疫排斥反应或反应较弱，适宜于不同个体之间的移植。使它在组织工程、神经系统疾病、肝脏疾病、心血管系统疾病、免疫系统疾病、视网膜疾病、糖尿病、肿瘤疾病等方面具有巨大的优势。

本实验就Rg1对hUCMSCs增殖特性的影响进行了研究，CCK-8检测结果显示Rg1各剂量对hUCMSCs的增殖有明显促进作用，而H2O2则明显抑制hUCMSCs增殖，Rg1对H2O2抑制hUCMSCs增殖的效应有明显逆转作用，且H2O2可明显抑制Rg1对hUCMSCs的促增殖效应。这一结果表明，Rg1对hUCMSCs增殖的作用明显，H2O2也明显抑制hUCMSCs的增殖，但Rg1可部分降低H2O2对hUCMSCs增殖的抑制作用。Rg1促进造血干祖细胞增殖的作用及本实验中Rg1促进hUCMSCs增殖提示，Rg1在hUCMSCs促进神经细胞再生与功能恢复中有良好的辅助效果。

p38是MAPKs超家族的成员之一，在细胞分化信号通路、细胞衰老、应激反应和许多疾病的发生和发展中起着至关重要作用[14]。JNKs家族是MAPKs超家族的另一个成员，JNK和(或)p38的活化促使炎症反应加重甚至细胞衰老[15,16]，与TNF-α炎性反应产生密切相关。此外，通过激活p38信号转导途径可以促进氧化应激的发生，诱导细胞衰老。p38 MAPK活化其下游通路可能导致干细胞周期停滞、衰老[17]。

本研究结果显示，H2O2损伤的hUCMSCs中TNF-α的水平升高，推测这可能是H2O2损伤的hUCMSCs发生炎性反应所致。我们加入Rg1后对hUCMSCs进行检测，结果发现，与模型组相比，Rg1各剂量组TNF-α、p-JNK和p-p38蛋白的表达降低，表明Rg1抑制H2O2损伤hUCMSCs导致的TNF-α、p-JNK和p-p38高活性，从而对H2O2损伤的hUCMSCs产生保护性作用，促进过氧化损伤的修复。

综上所述，Rg1可使hUCMSCs增殖增加，衰老细胞百分比减少，TNF-α、p-JNK、p-p38表达降低，表明Rg1可以对H2O2损伤的hUCMSCs产生保护性作用，促进过氧化损伤的修复。