不同水平阿散酸粪肥对水稻生长发育及砷积累的影响

何万领，李晓丽*，常会庆，杨肖娥

（1 河南科技大学动物科技学院，河南洛阳 471023；2 河南科技大学农学院，河南洛阳 471023；3 环境修复与生态健康教育部重点实验室/浙江大学环境与资源学院，杭州 310029）

砷 (As) 是广泛存在于自然界中的一种类金属元素。砷被认为是一种环境毒物，长期的砷暴露会引起各种健康效应[1–2]。但低剂量的砷对动物生长、繁殖具有促进作用，被认为是动物体必需的微量元素之一[3]。1964年美国最早允许有机砷制剂应用于鸡饲料中，1983年正式批准用作猪和鸡的促生长剂。阿散酸 (Asanilic acid，又名对氨苯胂酸) 作为砷制剂的一种，能够杀死肠道有害菌、控制动物腹泻、提高动物机体免疫力、改善饲料养分利用率和促进动物生长[4]。自1996年我国农业部正式批准作为动物饲料添加剂以来，阿散酸在畜牧养殖中被广泛应用。然而，阿散酸作为饲料添加剂在动物消化道内吸收较少，仅为10%～20%，大部分以原形随粪便排入

环境[5]，继而通过动物粪肥和灌溉的途径进入土壤。阿散酸在动物饲料中添加量一般为100 mg/kg左右[6]，而随动物粪便排出的阿散酸量将被3～10倍浓缩[7]，因此，长期施用或一次大量施入含阿散酸动物粪便的情况下极易造成高浓度阿散酸的污染。Garbarino等[8]对美国马里兰州长期施用鸡场废弃物的土壤样品检测发现，砷含量达10～50 mg/kg，相当于阿散酸28～145 mg/kg。本实验室对使用有机砷制剂的综合养殖区周围土样调查发现，排污口土壤、粪便堆积区和周围菜地中阿散酸含量可达32～129 mg/kg (数据未发表)。据推测，若按照当前阿散酸添加量，一个万头猪场每年向环境中排放的阿散酸及其代谢物约200 kg，16年后土壤含砷量可增加1倍[9]。进入土壤中的阿散酸可进一步降解为无机态砷，但此过程由于受阿散酸暴露浓度、时间、土壤性质等的影响，所需时间达几天到几十天甚至几个月。因此，研究阿散酸污染对作物的影响及砷向作物体内的迁移特点是十分必要的，但目前该部分研究较少，难以阐明畜牧养殖过程中砷制剂污染的环境效应及作用机制。为此，本文通过模拟阿散酸暴露试验研究阿散酸对水稻生长发育及砷积累的影响，为进一步研究阿散酸污染在食物链中的环境过程与机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 土壤样品

供试土壤样品采自河南科技大学试验牧场(34°6′30′′N、112°0′10′′E) 表层土，土壤类型为褐土，土壤基本理化性质为：pH 7.52、有机质 21.58 g/kg、阳离子交换量 16.73 cmol/kg、总氮 1.09 g/kg、有效磷 37.14 mg/kg、速效钾 82.36 mg/kg、总砷14.21 mg/kg。

1.2 含阿散酸粪肥制备

准确称取一定量饲料级阿散酸 (阿散酸含量35%) 溶于55～60℃水中，制成不同阿散酸浓度的水溶液，将阿散酸水溶液分别均匀喷洒于3份动物粪便上 (确保动物在饲养过程中不使用任何含砷制剂)，边喷洒边混合，并用少量超纯水反复清洗喷壶3次，清洗液同样均匀喷洒于粪便中，将粪便置于70℃恒温干燥箱内烘干，碾碎，过2 mm筛，以不加阿散酸粪便为空白对照。

1.3 试验土样制备

取0—20 cm土层农田土，除去土样中根系、树叶、杂物等，同时将大块土破碎，自然风干，再用木槌碾碎，过2 mm筛。按照每公顷22000 kg施用量将烘干的动物粪便与供试土混匀，从而制成含阿散酸为 30 mg/kg、75 mg/kg 和 150 mg/kg 的试验用土样。

1.4 栽培试验

采用盆栽试验，在15 L的塑料盆中盛10 kg风干的土壤。按照每公顷施用氮肥 (纯 N) 160 kg、钾肥(K2O) 240 kg、磷肥 (P2O5) 120 kg 的添加量，将三种肥料供体尿素、碳酸氢钾、磷酸二氢钠均匀拌入各土壤中，然后装盆。

所用水稻品种为徐稻3号，种子经过精选后育苗，于5叶期选择大小一至的稻苗移栽，移栽前土壤先淹水两天。按每盆3穴、每穴3株移栽，栽培管理参照水稻大田管理措施。每处理设6次重复，处理间随机排列。水稻种植当天，各处理取土样，分析其中阿散酸和总砷含量 (表1)。

1.5 样品采集与制备

植株样品采集分别在水稻分蘖期、开花期、成熟期进行，分蘖期和开花期样品分为根、茎、叶，成熟期样品分为根、茎、叶、稻壳和糙米。除籽粒之外的所有植株样品都先用自来水冲洗，再用蒸馏水清洗，所有样品 (籽粒除外) 在105℃下杀青30 min，之后在70℃下烘干至恒重，称重后用不锈钢磨样机 (DFT-50，大德中药机械有限公司，中国温岭) 进行粉碎备用；籽粒用糙米机 (JLGJ-45，台州市振国粮用器材厂，中国台州) 出糙，用玛瑙磨样机(MM301，Retsch 公司，德国) 粉碎。

表1 水稻种植当天各处理土样中阿散酸与总砷含量(mg/kg，DM)Table1 Total concentration of arsanilic acid(AA)and arsenic in soil samples of each group on the day of rice planting

1.6 土壤阿散酸含量测定

土壤中阿散酸的提取与检测参考郭瑞子等[10]报道的方法。准确称取干燥后的土样1.0000 g于15 mL离心管中，加入3 mL甲醇–乙腈混合液，混匀后，于8000 r/min离心10 min，获得上清液，40℃氮气吹干，用1 mL流动相溶解，加0.2 mL二氯甲烷混匀，于 12000 r/min 离心 10 min，过 0.22 μm 微孔滤膜。用高效液相色谱 (Waters-2695,美国Waters公司)法测定滤液中的阿散酸含量。流动相为40 mmol/L磷酸二氢钾溶液–甲醇 (96∶4，V/V)，超声波内脱气20 min，流速为 1.0 mL/min，进样体积 10 μL，检测波长244 nm，柱温为室温。

1.7 砷含量测定

分别准确称取土样、根样 0.1000 g，其他植株样品各0.5000 g于三角瓶中，加入20 mL浓硝酸、2.5 mL浓硫酸和1.25 mL高氯酸，加盖放置过夜。次日置电热板上160℃～170℃消解，至冒白烟时取出冷却，再加入5 mL去离子水蒸发至冒白烟，将余酸赶尽，冷却。用去离子水将消化液洗入50 mL容量瓶中，加10 mL 5% (W/V) 硫脲 + 抗坏血酸混合液，以 5% (V/V) HCl定容。用双道原子荧光光度仪 (AFS-9130，北京吉天仪器有限公司，中国北京) 测定消煮液中As含量。

1.8 统计分析

采用SPSS13.0中的ONE-WAY ANOVA模块进行统计分析，均值的多重比较采用Duncans方法进行，以P＜0.05作为差异显著性判断标准，结果以“平均值 ± 标准差”表示。作图采用Sigmaplot 13.0软件进行。

2 结果与分析

2.1 各组土样的阿散酸与总砷含量

从表1结果可知，对照土样中总砷含量为14.21 mg/kg，低于翁焕新等[11]报道的我国土壤背景值的上限15 mg/kg，可以作为对照土样用于砷污染试验；随着阿散酸添加量的增加，土样中总砷含量不断增加，其增加幅度与阿散酸增加幅度具有较好的相关性，说明各处理土样除受本试验阿散酸暴露外，没有受其他砷源污染的影响；由阿散酸实测值分析可知，在水稻栽培当天，各处理土样中阿散酸均有不同程度的降解，且阿散酸含量越低，降解率越高。

2.2 阿散酸对水稻生长发育的影响

由图1结果可知，与对照组相比，各阿散酸水平对水稻根系长度、单株根数及株高影响不显著 (P ＞0.05)；150 mg/kg阿散酸的无效分蘖显著高于对照和30 和 75 mg/kg 阿散酸处理 (P＜0.05)；随着阿散酸污染水平增加，水稻产量呈降低趋势，150 mg/kg阿散酸水稻产量显著低于其他各处理 (P＜0.05)，75 mg/kg阿散酸显著低于对照 (P＜0.05)，但与 30 mg/kg 阿散酸无显著差异 (P ＞ 0.05)。

2.3 阿散酸对不同时期水稻根、茎和叶中砷含量的影响

由表2结果可知，与对照相比，除30 mg/kg阿散酸处理成熟期水稻茎中砷含量无显著差异 (P ＞0.05) 外，其他各阿散酸处理分蘖期、开花期和成熟期根、茎和叶中砷含量均显著增加 (P＜0.05)。75 mg/kg阿散酸水稻分蘖期根中砷含量显著高于30 mg/kg阿散酸，而分蘖期茎、叶中砷含量及开花期和成熟期根、茎、叶中砷含量这两个浓度间无显著差异 (P ＞ 0.05)；与 75 mg/kg 阿散酸相比，150 mg/kg阿散酸各时期水稻各部位砷含量增加不显著 (P ＞0.05)，但与 30 mg/kg 阿散酸相比，150 mg/kg 阿散酸分蘖期根及开花期与成熟期根、茎和叶中砷含量显著增加 (P＜0.05)。

图1 不同水平阿散酸对水稻生长发育的影响Fig.1 Effects of different levels of arsanilic acid on rice growth development[注（Note）：方柱上不同字母表示处理间差异显著 (P＜0.05)Different letters above the bars indicate significantly different among treatments (P＜0.05).]

表2 不同水平阿散酸对不同时期水稻各部位砷含量的影响 (mg/kg，DM)Table2 Effects of different levels of arsanilic acid(AA) on arsenic content in different parts of rice at different growth stages

图2 水稻不同生育期根、茎和叶中砷含量Fig.2 Arsenic content in root, stem and leaf of rice at different growth stages

由图2结果可知，随着生育期进展，水稻根系中砷含量增加，在开花期时达到最高，成熟期呈减少趋势，且不同程度低于分蘖期。水稻茎中砷含量随生育期进展而增加，其中对照、30 mg/kg和75 mg/kg阿散酸处理时，茎中砷含量在开花期达到最高，成熟期减少，对照和30 mg/kg阿散酸成熟期茎中砷含量低于分蘖期；阿散酸处理水平为150 mg/kg时，水稻茎中砷含量表现为成熟期 ＞ 开花期 ＞ 分蘖期。随着水稻生育期的推移，叶中砷含量呈增加趋势，在阿散酸处理水平为30和75 mg/kg时，水稻叶中砷含量在开花期达到最高，成熟期呈减少趋势，其中对照和30 mg/kg阿散酸成熟期叶中砷含量低于分蘖期；阿散酸处理水平为150 mg/kg时，水稻叶中砷含量表现为成熟期 ＞ 开花期 ＞ 分蘖期。

2.4 阿散酸对水稻籽粒砷积累的影响

由表3结果可知，与对照相比，阿散酸各处理水稻颖壳、米糠、糙米和精米中砷含量显著增加 (P＜ 0.05)，随着阿散酸浓度增加，籽粒各部位砷含量呈增加趋势，与30 mg/kg阿散酸处理相比，75 mg/kg处理米糠和糙米中砷含量显著增加 (P＜0.05)，150 mg/kg处理颖壳、米糠、糙米和精米中砷含量均显著增加 (P＜0.05)。

砷积累量分析表明 (图3)，对照单株砷积累量糙米大于颖壳，阿散酸暴露使颖壳砷积累量不同程度大于糙米；与对照相比，阿散酸各处理颖壳和糙米中砷积累量均显著增加 (P＜0.05)；随着阿散酸浓度增加，颖壳和糙米中砷积累量均以 75 mg/kg阿散酸处理最大，其中颖壳砷积累量显著高于150 mg/kg阿散酸处理 (P＜0.05)，糙米砷积累量显著高于 30 mg/kg(P＜0.05) 和 150 mg/kg (P＜0.05) 阿散酸处理。与对照相比，随阿散酸浓度增加颖壳和糙米中砷积累量分别增加9.11、9.42、6.53倍和2.11、3.71、2.57倍。

3 讨论

3.1 不同水平阿散酸对水稻生长发育的影响

随着畜牧养殖过程中有机砷污染加剧，有机砷对农作物的影响受到广泛关注。但目前的一些研究多集中于洛克沙胂[12–15]，关于阿散酸暴露对作物生长发育的影响只有Wang等[16]进行过相关研究工作，研究发现，当按照砷浓度为10～50 mg/kg的梯度直接将阿散酸施入土壤后，阿散酸能够显著降低水稻株高、有效分蘖数、稻草产量和千粒重，并与砷处理浓度呈明显负相关。与其研究结果并不完全相同，本试验通过盆栽研究含阿散酸粪肥对水稻生长发育的影响，表明30～150 mg/kg水平阿散酸对水稻根系长度、单株根数和株高并无不良影响，但当阿散酸污染水平为75 mg/kg及以上时水稻无效分蘖增加，水稻产量显著降低。这一结果可能与阿散酸的加入方式不同有关，从而使得阿散酸在土壤中的降解效率和形态不同，对水稻的危害也不同。刘利军等[17]研究认为，有机砷制剂对植物体基本上是无毒的，但其在土壤中可降解为有毒产物，降解快慢和产物种类与多种因素相关，其中土壤有机质是主要因素之一。有机质能够促进阿散酸在其上的吸附作用，从而使阿散酸降解缓慢[18–19]。蒋成爱等[20]研究表明，有机质不但自身能牢固吸附阿散酸，而且其分解后形成的有机酸等产物可通过降低土壤pH的方式促进铁氧化物对阿散酸的吸附作用。奚功芳[21]对有机砷制剂洛克沙胂的研究表明，随着有机肥用量从1000 mg/kg增加到10000 mg/kg，洛克沙胂降解缓慢，低有机质组在处理第15天即完成降解过程，而高有机质组在45天时仍有超过50%的洛克沙胂未被降解，且这一过程与洛克沙胂处理浓度呈负相关。这是因为高浓度有机砷制剂能够抑制土壤微生物活动，从而降低有机砷处理前期微生物的降解效率[15]。就本试验而言，30 mg/kg阿散酸组虽降解较快，但其含砷量为8.4 mg/kg，有效态砷 (能够对水稻产生毒害的砷量)含量较低，不会对水稻产生明显的毒性作用[22]。当阿散酸含量在75 mg/kg及以上时，由于受动物粪肥及高浓度阿散酸抑制微生物活动的共同影响，降解缓慢，在水稻根系分化、株高生长的前期有效态砷含量低于毒性阈值。随着生长期推进，阿散酸分解增加，土壤有效态砷含量达到毒性阈值。研究表明，高浓度无机砷能够阻碍作物水分从根部向地上部的输送，从而难以满足灌浆期籽粒生长的需要[23]，此外，高浓度砷能够降低叶片叶绿素含量，使作物光合作用降低，造成营养不良，生长发育畸形[24–25]。通过比较穗部畸形水稻和正常水稻中砷含量发现，穗部畸形水稻穗中砷含量显著高于正常水稻中砷含量[26–27]。曹莹等[28]研究发现，当土壤砷处理浓度为40 mg/kg时，对水稻生长发育有显著抑制，砷浓度为60 mg/kg是水稻穗部畸形发生的临界水平。这可能是本试验150 mg/kg 阿散酸处理 (实测砷浓度为 62.06 mg/kg)水稻无效分蘖 (植株绿色、直立、颖壳畸形、不扬花结实等) 显著升高的主要原因。

表3 不同水平阿散酸对颖壳、米糠、糙米和精米中砷含量的影响 (mg/kg，DM)Table3 Effects of different arsanilic acid (AA) levels on arsenic content in rice husk, rice bran, brown rice and polished rice

图3 不同阿散酸水平对颖壳和糙米砷积累量的影响Fig.3 Effects of different arsanilic acid levels on the As accumulation of brown rice and husk[注（Note）：柱上不同字母表示相同植株部位处理间差异显著 (P ＜0.05) Different letters above bars mean significant difference among treatments for the same plant part (P＜0.05).]

3.2 不同水平阿散酸对水稻根、茎和叶中砷含量和迁移的影响

在相同生育期内，含阿散酸粪肥处理水稻各部位砷含量显著高于对照组，各部位砷积累量依次为根系 ＞ 叶 ＞ 茎 ＞ 颖壳 ＞ 籽粒。这与早期对无机砷污染的研究结果一致[29]，也符合水稻器官砷积累的一般规律。研究表明，水稻根系存在的铁膜是砷在根际富集的主要原因，并同时固定砷、有效减少其向水稻地上部的转运[30]。随着阿散酸浓度增加，分蘖期、开花期和成熟期水稻各部位砷积累表现出相似的趋势，且不同生长时期水稻各部位砷积累量存在不同，这与早期研究结果一致[14]。对整个生育期水稻各部位砷积累分析发现，在阿散酸水平为0～75 mg/kg时，水稻根、茎、叶具有相似的积累特性，即随着生长期各部位砷积累逐渐增加，在开花期达到最高，成熟期呈下降趋势，这也与早期的研究结果相似[14,31]；然而，本试验 150 mg/kg阿散酸水平各部位砷积累特性并不完全相同，表现为根部随生长期推移与0～75 mg/kg水平具有相似的特点，茎叶中砷含量随生长期积累增加，并在成熟期积累量最大。这一结果可能与阿散酸的降解率及有效砷水平有关，30 mg/kg和75 mg/kg阿散酸降解较快且有效砷未达到使地上部畸形发育的剂量，水稻在正常的吸收和转运机制下完成砷的积累，并符合一般积累规律，即生育旺盛期富砷能力强，生育后期由于根系铁膜老化以及地上部砷的损失等导致砷含量呈下降趋势[32–33]。相反，150 mg/kg组地上部无效分蘖 (植株绿色、直立、颖壳畸形、不扬花结实等) 多，茎叶砷损失量少，且向籽粒中转运少，从而导致茎叶中具有较高的砷积累量。

3.3 不同水平阿散酸对水稻籽粒砷积累的影响

砷向水稻籽粒迁移的多少关系到人类的食物安全问题。早期研究已证实，水稻籽粒砷含量与土壤砷浓度有关，并因水稻品种不同而异[34–36]。一些调查发现[37]，近些年随着环境砷污染加重，各地区或国家稻米中砷含量呈不同程度的升高趋势，污染严重区水稻籽粒砷含量可达0.5～7.5 mg/kg。安晨昕等[38]研究表明，随着灌溉水中砷浓度增加，稻米籽粒中砷含量不断增加，当灌溉水中砷浓度由0.09 mg/kg增加到0.14 mg/kg和0.27 mg/kg时，精米中砷含量显著增加。陈成[25]研究表明，与10 mg/kg砷含量组相比，当土壤中砷含量为35 mg/kg和53 mg/kg时，水稻籽粒中砷含量极显著增加，53 mg/kg组籽粒砷含量较35 mg/kg组显著增加。与以上研究结果相似，本试验中随着土壤阿散酸污染水平增加，水稻颖壳、米糠、糙米和精米中砷含量均呈增加趋势，与30 mg/kg阿散酸组相比，75 mg/kg组米糠和糙米中砷含量显著增加，150 mg/kg组水稻籽粒各部位砷含量均显著增加。颖壳和糙米中砷积累量分析表明，随着阿散酸暴露水平的增加，砷积累量呈增加趋势，并在75 mg/kg时达到最大，150 mg/kg时降低，这一结果可能与150 mg/kg阿散酸组水稻籽粒产量显著低于75 mg/kg组有关，从而使得单株水稻颖壳和糙米中砷积累量显著降低。随着阿散酸水平增加，水稻颖壳和糙米砷积累较对照组分别增加9.11、9.42、6.53倍和2.11、3.71、2.57倍，这表明，土壤阿散酸污染对稻米可食部砷积累存在潜在安全风险。

以上可知，通过本盆栽模拟试验能够很好地反映阿散酸污染对水稻生长发育及砷积累的影响，初步揭示出阿散酸暴露对水稻生长发育及砷积累的影响与暴露浓度及暴露时间密切相关，即暴露浓度越大，时间越长越不利于水稻的生长发育，且水稻植株各部位砷积累量呈增加趋势。但本试验尚存在一些问题：1) 与传统的粪肥施用方法存在一定差距。一般情况下动物粪肥在熟化后施用，这一过程可能更有利于阿散酸的降解，且其降解产物的种类和毒性作用与在土壤中的降解作用不同，相应的对水稻的毒害作用也不同；2) 就本试验结果而言，75 mg/kg阿散酸水平已对水稻稻穗分化和稻米产量产生不利影响，而30～75 mg/kg的阿散酸梯度是否产生不利影响有待进一步研究；3) 在农艺措施与水稻生长相互作用下，阿散酸在土壤中的降解规律尚不清楚，有待进一步的研究工作。

4 结论

在0～150 mg/kg污染水平，阿散酸对水稻根长、单株根数及株高无不利影响，随着污染水平增加，阿散酸能够显著影响水稻稻穗分化和稻米产量，75～150 mg/kg阿散酸污染水平使水稻稻米产量减少25%～45%。因此，长期大量施用含阿散酸粪肥势必造成我国主要粮食作物的减产。

从砷积累来看，水稻各部位砷积累随阿散酸污染水平增加而增加，其分布规律与无机砷污染相似，即根积累量最多，依次为叶和茎；阿散酸污染能够增加水稻可食部砷安全风险，阿散酸水平为75～150 mg/kg时，稻米可食部砷积累增加2.11～3.71倍，糙米砷含量达1.04～1.19 mg/kg，精米砷含量达0.21～0.27 mg/kg，均超过了我国稻米砷限量标准0.2 mg/kg(GB2762-2012)。

总之，在以褐土为试验土壤、施用含阿散酸非堆沤粪肥每公顷22000 kg的情况下，土壤阿散酸水平为75 mg/kg及以上时即对水稻品种徐稻3号产生不利影响，并造成稻米可食部砷积累风险。因此，建议在上述土壤类型、粪肥处理方式与用量，甚至作物品种相同的情况下，施用阿散酸污染的粪肥时，应检测阿散酸含量，确保施用后土壤阿散酸含量不超过 75 mg/kg。