小檗碱对肠道菌的抑制作用

林媛，张红娟，韩燕星，蒋建东

小檗碱（berberine，C20H19NO5，Mw 336.37）是一种具有广泛药理作用的异喹啉类生物碱，在体内可以发挥降糖、降脂、抗氧化、抗感染等多种功能[1-2]。其中，小檗碱对肠道细菌感染的治疗作用是最早被人们认识并运用到临床当中的[3]。而小檗碱治疗肠道细菌感染的基础是其容易集留在肠道中，并且有利于改善肠道菌的菌群失衡[4]。

肠道菌群是一个复杂的由多种细菌共同组成的菌群系统，参与机体的多种生理过程。早期研究中，肠道菌群更多的被认为是和消化、营养吸收密切相关。随着研究的深入，人们逐渐发现肠道菌群还和人体的健康密切相关，比如能通过自身屏障影响机体免疫，菌群失调与糖尿病、心血管疾病、肥胖等代谢性疾病有重要关系等[5-6]。肠道菌群更像是一个隐形的“器官”，影响着人类的健康。肠道菌群种类繁多，包括肠杆菌、肠球菌、双歧杆菌、乳酸杆菌、拟杆菌、芽孢杆菌等。在这些肠道菌中，大部分都属于专性厌氧菌，也是共生菌。还有少数一些细菌属于致病菌，比如导致腹泻的痢疾志贺菌、弗氏志贺菌，引起食物中毒的沙门菌等[7]。

本文通过测定小檗碱对多种肠道微生物的体外抑制作用，以及小檗碱对代表性肠道菌群生长曲线的影响，为小檗碱与肠道菌的相互作用研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 盐酸小檗碱购于中国药品生物制品检定研究院；左氧氟沙星（Levo）购于美国Sigma 公司；LB、NB、MRS、TSA、RCM 微生物培养基均购于美国 BD 公司。

1.1.2 菌株 沙门菌、弗氏志贺菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳酸杆菌、产气荚膜梭菌、艰难梭菌、丁酸梭菌均购买于美国标准生物品收藏中心（ATCC）；痢疾志贺菌、致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、产气肠杆菌、阿氏肠杆菌、阴沟肠杆菌、阪崎肠杆菌、单增李斯特菌购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）。

1.1.3 仪器 Orion Model 828 型电子 pH 计为德国 Sartorius 公司产品；MCV-B161Sb 超净工作台为日本 Sanyo 公司产品；NBS Innova 4 落地式变温摇床购于德国 Eppendorf 公司；Spectrostar 分光光度计为德国 BMG Labtech 公司产品；AW 200SG 型厌氧培养箱购于英国 Electrotek 公司。

1.2 方法

1.2.1 菌种活化 取冷冻干燥的待测菌株，在超净工作台中接入无菌的相应液体培养基中，置于37 ℃ 摇床 180 r/min 过夜培养（需氧细菌在普通变温摇床中培养，厌氧细菌在厌氧箱摇床中培养）。

1.2.2 药物溶液配置 将盐酸小檗碱用 DMSO溶解，在超净工作台中以 0.22 μm 微孔滤膜滤过，配置成 5 mg/ml 的药物储存液。之后再用相应的培养基倍比稀释成 2.048、1.024、0.512、0.256、0.128、0.064、0.032、0.016 mg/ml 药物使用液。左氧氟沙星也以相同的方法配置成 0.032、0.016、0.008、0.004、0.002、0.001 mg/ml 药物使用液。同时设立不加小檗碱的相同浓度的 DMSO 溶液（也以相应的培养基稀释）作为空白对照。

1.2.3 小檗碱对不同肠道菌群最小抑菌浓度（MIC）的测定 使用试管倍比稀释法进行测定。取无菌试管 9 支，每支加入 1 ml 待测细菌培养液（106CFU/ml），第 1 支至第 8 支分别加入倍比稀释的盐酸小檗碱使用液 1 ml，至终浓度分别为1.024、0.512、0.256、0.128、0.064、0.032、0.016、0.008 mg/ml，第 9 支加入不加药的培养基作为空白对照。左氧氟沙星也以同样的方法稀释至药物终浓度为 0.016、0.008、0.004、0.002、0.001、0.0005 mg/ml。将各个试管分别置于 37 ℃ 摇床中振荡过夜培养。12 h 后观察细菌生长情况。与空白对照相比，液体清澈为有抑菌活性，混浊为有细菌生长。无细菌生长的最小药物浓度即为 MIC 值。

1.2.4 小檗碱对细菌生长曲线的影响 选取有代表意义的 4 株菌株：金黄色葡萄球菌ATCC25923、痢疾志贺菌 CICC10983、弗氏志贺菌ATCC12022、沙门菌 ATCC13076。将待测菌培养至对数生长期，用相应培养基稀释至 106CFU/ml。以盐酸小檗碱 1/8、1/4、1/2 倍 MIC 作为加药浓度，同时设立不加药的空白对照。放入 37 ℃ 摇床中振荡培养，在 0 ～ 12 h 每隔 1 小时取样 0.5 ml。用分光光度计测量OD600值。以培养时间为横坐标，OD600值为纵坐标，绘制不同加药浓度下细菌的生长曲线。

2 结果

2.1 小檗碱对不同肠道菌的体外抑制作用

小檗碱对 24 株肠道菌包括需氧菌、厌氧菌，均表现出不同程度的抑制作用，尤其是对能够引起肠道感染的痢疾志贺菌、弗氏志贺菌抑制作用较强（64 μg/ml），而对肠道正常菌群普通大肠杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌抑制作用较弱（＞ 1024 μg/ml）（表 1）。

表 1 小檗碱对不同肠道菌群的抑制作用Table 1 The inhibitory effects of berberine to intestinal bacteria

图 1 小檗碱对肠道菌生长曲线的影响（A：金黄色葡萄球菌；B：弗氏志贺菌；C：痢疾志贺菌；D：沙门菌）Figure 1 The effect of berberine on growth curve of intestinal bacteria (A: Staphylococcus aureus; B: Shigella flexneri; C: Shigella dysenteriae; D: Salmonella)

2.2 小檗碱对肠道菌生长曲线的影响

选取具有代表意义的肠道菌金黄色葡萄球菌、痢疾志贺菌、弗氏志贺菌、沙门菌为待测菌，绘制不同浓度下细菌的生长曲线。由图 1 可见，无论小檗碱浓度高低，所有加小檗碱的肠道菌生长曲线在对数生长期和稳定期都位于对照组之下，表明小檗碱对对数生长期和稳定期的 4 种肠道菌均产生了明显的抑制作用，并且随着小檗碱浓度的增高，其抑制作用也增强。由于高浓度小檗碱溶解性不好，影响了分光光度计对OD600的检测，所以我们只测定了低于 MIC 的小檗碱浓度对肠道菌生长的影响。在引起肠道细菌感染的痢疾志贺菌、弗氏志贺菌、沙门菌中，可以看到痢疾志贺菌生长最快，弗氏志贺菌、沙门菌生长相似且较为缓慢。加药后，小檗碱对痢疾志贺菌的抑制也较为平缓，对弗氏志贺菌、沙门菌的抑制在对数生长期较大。小檗碱对痢疾志贺菌仅延长迟缓期，几乎不影响其倍增时间；但是对沙门菌和弗氏志贺菌则不同，小檗碱明显增加了沙门菌和弗氏志贺菌的倍增时间。

3 讨论

本文选取 24 株常见的肠道细菌，通过在体外测定盐酸小檗碱的抑菌活性，可以看出小檗碱的抗菌活性并不强，其 MIC 大部分在 64 μg/ml 以上，远远低于阳性对照药左氧氟沙星。而临床将小檗碱用于治疗胃肠道感染却有显著的治疗效果。我国将小檗碱用于临床治疗胃肠道感染的最早报道见于1957 年[8]，近几十年来，广大医生和人民群众都已经将小檗碱作为非处方药用于各种腹泻的治疗。大量研究结果表明，小檗碱治疗胃肠道感染的机制，除了对致病肠道菌有一定的抑制作用之外，还在于小檗碱能够改善肠道菌群的平衡、对胃肠道黏膜功能有保护作用[9]。通过本研究的测定也可以看出，小檗碱对肠道菌群中的有害菌（痢疾志贺菌、弗氏志贺菌、沙门菌等）的抑制作用较强。也有报道指出，小檗碱还能够增加有益的肠道菌，如能够增加具有短链脂肪酸（SCFA）产生功能的Blautia和allobaculum等菌属，而 SCFA 能够调节肠道 pH值、抗炎、调节人体代谢与免疫[4]。

MIC 值是一个常用的反映药物对细菌抑制作用的数值[10]，但不能反映药物对细菌整个生长周期的影响。本文通过绘制小檗碱对 4 种代表性肠道菌作用的生长曲线，动态地反映了小檗碱作用 0 ～12 h 范围内对 4 种肠道菌的影响。实验结果中，我们可以看到，小檗碱对痢疾志贺菌仅延长迟缓期，几乎不影响其倍增时间；但是对沙门菌和弗氏志贺菌则不同，小檗碱明显增加了两者的倍增时间。推测其原因，有可能是小檗碱通过对痢疾志贺菌某些基因的调控导致其在迟缓期的代谢受到抑制。而对于沙门菌和弗氏志贺菌，小檗碱可能主要影响其分裂期的相关基因表达或者酶的活性。具体作用机制，需要通过实验进一步深入验证。本研究为今后探讨小檗碱抑制肠道菌生长的规律以及小檗碱与肠道菌相互作用提供一定参考。