耐碳青霉烯类药物鲍氏不动杆菌cprD基因突变分析及耐药元件研究

陈彩云，吴庆，赖红娟

耐碳青霉烯类药物的细菌菌株是耐药程度较为严重的菌株，其不仅对碳青霉烯类药物表现为耐药，同时对青霉素及头孢一代至四代药物也表现为耐药。耐碳青霉烯类药物鲍氏不动杆菌的原因往往为菌株生产具有对碳青霉烯类药物有水解活性的 -内酰胺酶和/或菌株自身的膜孔蛋白D基因发生突变相关[1]。近年来，尽管国内有较多关于鲍氏不动杆菌耐药基因（耐药机制）的报道，但涉及鲍氏不动杆菌D基因突变的研究较为罕见[2-4]。因此笔者收集了一组耐碳青霉烯类药物鲍氏不动杆菌，对其进行了D基因突变分析和 33种B-内酰胺类药物耐药基因，16种氨基糖苷类药物耐药基因和 10种可移动遗传元件（MGEs）检测，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 细菌来源 收集2015年 1月至2017年12月浙江省泰顺县人民医院住院患者痰标本分离的菌株20株。

1.2 菌种鉴定和药敏试验 菌株鉴定采用法国梅里埃公司 VITEK2compact细菌鉴定仪，抗菌药物药敏试验梅里埃公司 VITEK2compact细菌鉴定仪和Kirby-Bauer纸片扩散法。

1.3 细菌DNA制备 为蛋白酶K水解裂解法，试剂盒由无锡市克隆遗传技术研究所提供。

1.4 基因检测 全部耐药基因检测均为聚合酶链式反应（PCR）法，检测项目：膜孔蛋白 oprD基因和32种 B-内酰胺酶基因，共 33种B-内酰胺类药物耐药基因，16种氨基糖苷类药物耐药基因，10种MGEs。全部PCR引物由无锡新吴区新克隆数据分析工作室设计并获授权使用，PCR扩增盒由无锡市克隆遗传技术研究所提供。

1.6 菌株间亲缘关系分析 测得结果作样本聚类分析（UPGMA法）。样本聚类分析由无锡新吴区新克隆数据分析工作室完成。

2 结果

2.1 抗菌药物敏感性试验结果 20株耐碳青霉烯类药物鲍氏不动杆菌不仅对碳青霉烯类药物（亚胺培南、美洛培南）表现为耐药，对第三、第四代头孢及复合制剂亦表现为耐药，12种抗菌药物的耐药率均为100.0%。见表1。

2.3 耐药元件检测结果 20株耐碳青霉烯类药物鲍氏不动杆菌D突变率达100.0%；另外 TEM、 ADC、OXA-23 群、 OXA-66、’-Ⅰb、3’-Ⅰ、 Ⅰ1、ISaba1的检出率亦均达100.0%。见表2。

2.4 亲缘关系分析 20株菌有明显的聚集性，且有3个克隆播散，见图1。

3 讨论

抗菌药物敏感性试验结果显示，20株菌不仅对碳青霉烯类药物均表现为耐药，对第三、第四代头孢及复合制剂亦均表现为耐药。对D基因作PCR扩增及DNA测序，20株菌测得序列一致。将测得DNA序列转为氨基酸序列后获得一条长438个氨基酸残基的序列，经与SDF株比对，有4个氨基酸残基序列不同，即20株耐碳青霉烯类药物鲍氏不动杆菌D突变率达100.0%。序列决定结构，结构决定功能，序列改变将导致功能改变。另外，20株菌 TEM、 ADC、OXA-23群、 OXA-66等4种 -内酰胺酶基因均为 100.0%检出率。因此可以推测本文菌株耐上述 -内酰胺类药物是菌株D突变与同时携带4种 -内酰胺酶基因的合力结果。

表1 20株耐碳青霉烯类药物鲍氏不动杆菌对抗菌药物耐药情况 %

表2 20株耐碳青霉烯类药物鲍氏不动杆菌耐药元件检测结果 株（%）

本文菌株对3种氨基糖苷类药物均表现为耐药，20 株菌 2’-Ⅰb、3’-Ⅰ等2种氨基糖苷类药物耐药基因检出率均为100.0%；另外， (3)-Ⅰ、 (6′)-Ⅰb、 (3”)-Ⅰ、 A等4种氨基糖苷类药物耐药基因检出率均在75.0%以上。这些就是导致耐氨基糖苷类药物的原因。

本组20株菌有明显的聚集性，且有3个克隆播散。2号株、4号株、5号株、6号株、8号株、9号株、10号株、11号株、12号株、14号株、16号株、17号株等12株为第1个克隆[均存在oprD突变与携带 TEM、 ADC、 OXA-23群、OXA-66、 2’-Ⅰb、 (3)-Ⅰ、 (6’)-Ⅰb、 (3”)-Ⅰ、3’-Ⅰ、 A、1U513、ISaba1、IS26]；1 号株、18号株、20号株等3株为第2个克隆（均存在D突变与携带 TEM、ADC、 OXA-23群、 OXA-66、2’-Ⅰb、 (3)-Ⅰ、 (6’)-Ⅰb、(3”)-Ⅰfffcc03’-Ⅰ、fffcbfⅠ1、fffcbeU、fffcbd513、ISaba1、IS26)；3号株、6号株为第3个克隆(均存在oprD突变与携带 TEM、ADC、fffcbcOXA-23 群、fffcbbXA-66、fffcbaⅠb、fffcb93’-Ⅰ、fffcb8Ⅰ1、fffcb7U、fffcb6513、ISaba1、IS26)。可见这 3 个克隆的菌株均为携带了多种 -内酰胺类药物耐药基因、多种氨基糖苷类药物耐药基因和多种MGEs。

图1 20株耐碳青霉烯类药物鲍氏不动杆菌菌株耐药元件检测结果的样本聚类分析