4种特殊染色法在肝脏穿刺活检病理学检查中的应用比较

李萍，丛玲华，钟国平，王玲娣

慢性肝病是我国患病率较高的疾病，尤以乙型肝炎（乙肝）最为常见。如不及时治疗，部分患者随着病情进展容易转化为肝硬化、肝功能衰竭甚至肝癌[1]。其中肝内结缔组织异常增生导致的肝纤维化，是慢性肝炎向肝硬化甚至肝功能衰竭发展的重要阶段，病理组织学检查是评定炎症及纤维化程度最为准确的方法[2]。免疫组化染色法敏感性高、特异性强，但该方法成本高，且很多基层医院由于条件限制无法开展免疫组化检验。本文收集55例慢性肝病患者，应用 Masson、Gomori、铜盐及含铁血黄素4种特殊组织染色法对肝穿刺组织进行病理组织学结构观察，探讨各方法的染色阳性检出率，以及特殊染色法在肝穿刺组织中的诊断价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 材料 收集55例各种慢性肝病肝穿刺组织的石蜡包埋组织切片，来源为宁波市鄞州人民医院病理室的肝活检标本，切取石蜡包埋切片作Masson、Gomori、铜盐及含铁血黄素染色。所有患者均依据2015年《中国慢性乙肝防治指南》诊断标准进行诊断，55例中慢性肝炎22例（轻度15例、中重度7例），免疫性肝损伤8例，肝硬化15例（早期肝硬化7例），肝脏肿瘤10例。相关试剂：Masson染色试剂盒（福州迈新生物技术公司），Gomori染色试剂盒（珠海贝索生物技术有限公司），铜盐染色液（Solarbio公司），含铁血黄素染色试剂盒（福州迈新生物技术公司）。

1.2 方法

1.2.1 Masson染色 将石蜡切片常规脱蜡至水充分冲洗，用0.25%高锰酸钾氧化5 min，2%草酸漂白，Masson复合液浸染10 min，用0.2%醋酸水冲洗，光绿液浸染5min，用0.2%醋酸水冲洗，后脱水、透明及封片。

1.2.2 Gomori染色方法 将石蜡切片常规脱蜡至水充分冲洗，高锰酸钾氧化5min，2%草酸漂白，水洗，2%硫酸铁铵媒染2min，ddH2O冲洗，氨性银液1 min，ddH2O冲洗2次，20%甲醛还原5 min，ddH2O冲洗2次，0.2%氯化金1 min，ddH2O冲洗2次，丽春红S苦味酸液复染3～5min，后脱水、透明及封固。

1.2.3 铜盐染色 将石蜡切片常规脱蜡至水，切片入红氨酸染色液，37℃水浴染色24h，70%乙醇及ddH2O分别冲洗，晾干，核固红染色液染色1 min，ddH2O洗涤，后脱水、透明及封固。

1.2.4 含铁血黄素染色 将石蜡切片常规脱蜡至水充分冲洗，将亚铁氰化钾试剂（试剂A）和促染剂（试剂B）等量混合后滴加1滴（0.1 ml)于组织中孵育10～20 min，ddH2O 充分洗涤，滴加 1 滴（0.1 ml）中性红复染液（试剂C）复染5～10min，ddH2O洗涤，后脱水、透明及封固。

2 结果

Masson染色阳性结果为：在点状坏死区可见染成绿色的胶原纤维增粗、融合（封三彩图3）；Gomori染色阳性结果为：网状纤维有黑色沉积的银颗粒，肝小叶内网状纤维支架构，坏死区网状支架塌陷、融合、深染，并形成向肝小叶内延伸的宽窄不一的纤维间隔，局部形成假小叶（封三彩图4）；铜盐染色阳性结果为：肝组织内有弥漫性红氨酸铜颗粒沉积，主要见于汇管区周围变性肝细胞的胞质内，肝小叶内其他部位也有少量的阳性铜颗粒（封三彩图5）。含铁血黄素染色阳性结果为：肝组织内有大量弥漫性普鲁士蓝铁颗粒沉积（封三彩图6）。

4种染色方法对重症肝病患者的阳性检出率均较高，如在9例肝细胞癌、8例肝硬化肝组织中均呈强阳性；4种方法在免疫性肝损伤和慢性肝炎患者的检出结果有所不同，6例免疫性肝损伤和6例慢性肝炎患者强阳性、8例慢性肝炎患者弱阳性（Masson染色法）；2例慢性肝炎患者强阳性，5例免疫性肝损伤和9例慢性肝炎患者弱阳性（铜盐染色法）；7例免疫性肝损伤和5例慢性肝炎患者强阳性，1例免疫性肝损伤和9例慢性肝炎患者弱阳性（含铁血黄素染色法）；5例免疫性肝损伤和5例慢性肝炎患者强阳性，1例免疫性肝损伤和10例慢性肝炎患者弱阳性（Gomori染色法）。见表1。

Masson染色和Gomori染色两种方法灵敏度较高，尤其对于轻度肝病的检出，较另外两种方法阳性率高，但Gomori染色相对较繁琐，成本较高，在操作时间上，铜盐染色法耗时较长，且对于轻度肝病的阳性检出率较低。见表2。

3 讨论

Masson法是经典且经济实用的胶原纤维染色法，胶原纤维色泽鲜艳，切片背景清晰，对比度强；能清楚的显现出肝组织内胶原纤维分布状况、沉积增生以及汇管区周边纤维增生情况，对于慢性肝炎纤维化程度、范围及肝内结构改变的判断都具有直观性[3]。Masson法辅助HE染色在评价肝纤维化程度以及慢性乙肝、肝硬化病理学诊断中具有重要的应用价值[4]。

网状纤维是肝窦与肝细胞的主要支架[5]。Gomori染色法可将网状纤维染成黑色网状，用该染色方法可很好地显示肝硬化再生结节的特征、增生病变、肿瘤及纤维化程度，也可定期评估非肝硬化门脉高压症的进程。除早期高分化HCC之外，一般癌组织内网状纤维较少，与肝细胞腺瘤等的鉴别需结合其他方法[6]。

表1 55例不同肝病各染色阳性检出率比较 例（%）

表2 4种组织学染色方法比较

肝内瘀血程度是判断慢性乙肝及肝硬化病情加重的关键因素[7]。含铁血黄素是一种血红蛋白源性色素，是组织内沉着的铁质的主要存在方式，含铁血黄素染色法主要用以显示和证明组织内的各种局部出血性病变。免疫性肝损伤以及中、重度肝炎患者肝内常有陈旧性出血，因此，采用含铁血黄素染色法阳性率较高。此方法对血色病、病毒性肝炎、酒精性肝病、肝硬化及肝血管内皮细胞损伤等引起的铁蛋白色素颗粒增多均有很好的显色效果[8]。

铜在正常人体组织内含量极少，当肝豆状核变性或肝硬化时，铜含量明显增加，红氨酸与铜盐反应生成的红氨酸-二亚胺型铜盐沉淀呈墨绿色；因此铜盐染色法（红氨酸法）适于诊断肝炎、肝硬化、药物性肝损伤及原发性硬化性胆管炎等引起的肝细胞或胆管内的胆色素增多，还可用于诊断和鉴别慢性胆汁淤积、Wilson病及 1-抗胰蛋白酶缺乏症[9]。

特殊染色除了本文所用到的方法之外，还有可显示弹性纤维和慢性B型肝炎中HBsAg的维多利亚蓝染色，可显示纤维板层型或透明细胞型HCC、酒精性肝病时出现的Mallory小体、阿米巴和真菌的PAS染色，可显示慢性病毒性肝炎、肝硬化、原发性胆管炎及药物性肝损伤所致的胆色素增多的Hall染色法等[9-10]。虽然特殊染色法溶液配制复杂，且检验敏感性、信号特异性及背景清晰度虽不如免疫组化和分子病理学分析的技术；但其不需要特殊的仪器及设备，成本低，试剂便宜，可反复使用，特殊染色收费不高，也更易被患者所接受，适于基层医院或病情的初筛。