一种防PM2.5喷雾对空气污染致大鼠肺部炎症反应的保护作用研究

初 明，王月丹 （北京大学医学部基础医学院，北京100191）

0 引言

2012年，联合国环境规划署公布的《全球环境展望5》中指出，每年有近200万的过早死亡病例与颗粒物污染导致的呼吸系统疾病有关。《美国国家科学院院刊》（PNAS）也发表了研究报告称，人类平均寿命因为空气污染已经缩短了约5年半［1］。2013年10月17日，世界卫生组织下属国际癌症研究机构首次指出大气污染对人类致癌，并明确了颗粒物是主要的环境致癌物。

颗粒物污染系悬浮在空气中的固体或液体颗粒物，因对生物和人体健康造成危害而得名。颗粒物种类很多，一般指 0.1～75 μm 的化学烟雾、煤烟、烟、尘粒、粉尘和雾尘。其中，PM2.5是指大气中直径小于或等于2.5 μm的颗粒物，也称为可入肺颗粒物，其直径还不到人头发丝直径的1／20。与较粗的大气颗粒物相比，PM2.5多为带正电荷的“阳离子”颗粒，粒径小，活性强，比表面积大，易附带有毒、有害物质，如重金属、微生物等，且在空气中停留的时间长，分散的距离远，因而对人体健康的影响更大。大量研究［2-10］表明，颗粒物直径越小，进入呼吸道的部位越深，直径10 μm的颗粒物PM10通常沉积在上呼吸道，直径小于2.5 μm 的颗粒物 PM2.5可深入细支气管和肺泡，直接影响肺的通气功能，造成肺组织的损伤，引起哮喘、肺功能下降、呼吸系统炎症，累及心血管系统、神经系统、免疫系统，并促进癌症的发生。PM2.5颗粒物污染不仅威胁人类的健康，而且对社会造成了巨大的经济负担。因此，结合科学研究，预防PM2.5迫在眉睫。本研究通过动物空气暴露试验研究一种防PM2.5喷雾对空气污染导致大鼠肺部炎症反应的保护作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级的成年 SD大鼠，雄性40只，体质量343～395 g。实验动物均购于北京大学医学部实验动物科学部，动物合格证号：SCXK（京）2011-0012，常规饲养于北京大学医学部实验动物科学部的SPF级动物室，12 h光照，温度22～24℃，湿度（55%±15%）。

1.2 主要试剂一种防 PM2.5喷雾（专利号：ZL201410108955.9，由北京意嘉健康科技有限公司提供）［11］，这种防 PM2.5喷雾能够在皮肤的表面形成正电场，通过静电排斥的原理有效减少PM2.5通过呼吸系统进入肺部；RNA提取试剂盒（美国Invitrogen公司）；逆转录聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒（美国 Invitrogen公司）；Trizol试剂（美国Invitrogen公司）；大鼠IL-4、IL-6和TNF-α的酶联免疫（ELISA）检测试剂盒（美国R＆D公司）。

1.3 主要设备大气PM2.5吸入暴露装置（由北京大学环境科学与工程学院提供）［12］。装置的放置点距离北京市北四环西路1000米。北京市北四环西路是北京市的主干道，每日承载220 000辆机动车通行。室外大气经进气口导入染毒柜或洁净柜后排出，气流量 300～350 L／min。 气体进入染毒柜前经 PM2.5切割器滤除空气动力学当量直径≥2.5 μm的颗粒物，从而使进入染毒柜内的颗粒物直径＜2.5 μm，且与外界PM2.5浓度保持一致；气体进入洁净柜前经 PM2.5切割器过滤再经高效空气过滤器（high efficiency particulate air filter，HEPA）滤除全部颗粒物，使进入洁净柜内的空气不含大气颗粒物。染毒柜与洁净柜内其他气态污染物浓度相同。其他主要设备包括便携式PM2.5检测仪（KHS-PMA，北京清风康华科技有限公司）；酶标仪（Thermo MK3，美国 Thermo公司）；正置荧光显微照相系统（BX53，日本 Olympus公司）；NanoDrop One分光光度计（美国Thermo公司）；实时荧光定量PCR仪（7500 Fast，美国Applied Biosystems公司）。

1.4 动物空气暴露实验按照不同处理方法设过滤空气-去离子水组（简称空气-纯水组）、空气-防 PM2.5喷雾组（ 简称空气-喷雾组）、PM2.5-纯水组、PM2.5-喷雾组，每组10只，暴露时间为90 d。暴露点的空气PM2.5浓度采用便携式 PM2.5检测仪检测，每日 8：30、12：30 和 16：30 检测暴露点实时 PM2.5水平，取平均值与国家环境监测站的同期监测数据进行比较。空气-喷雾组和 PM2.5-喷雾组每日 8：30、12：30 和16：30对大鼠的口鼻及面部雾化喷雾10 s。空气-纯水组和PM2.5-纯水组以雾化纯水10 s处理。 其中，以空气-纯水组为阴性对照组，以PM2.5-纯水组为阳性对照组。

1.5 标本采集第91天，大鼠腹腔注射50 g／L戊巴比妥50 mg／kg。麻醉处死后，暴露气管，气管插管，结扎右肺叶，行左肺支气管肺泡灌洗，每次3 mL，重复3次，回收率约83%，收集大鼠BALF。取右肺中叶（未经灌洗），行4%多聚甲醛固定，并进行病理组织切片，HE染色，在光学显微镜下观察肺组织形态学变化。

1.6 BALF中炎症细胞因子含量检测采用ELISA法，检测BALF中IL-4、IL-6和TNF-α的含量。分别设标准品孔和待测样品孔，每孔分别加标准品或待测样品100 μL，混匀，37℃孵育 2 h；洗板 3 次，每孔加入100 μL生物素标记的抗体工作液（1∶10 000），37℃孵育1 h；洗板3次，每孔加入100 μL辣根过氧化物酶标记的亲和素工作液，37℃孵育1 h；洗板3次，每孔加入 90 μL底物工作液，37℃避光显色30 min后，每孔加50 μL终止液。反应终止5 min内酶标仪检测吸光度值，检测波长为450 nm。

1.7 肺组织中炎症细胞因子mRNA表达检测采用qPCR法检测大鼠肺组织中IL-4、IL-6和TNF-α的mRNA表达量。按照试剂盒说明书提取大鼠肺组织的总RNA，并进行mRNA反转录。基因引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。基因引物序列如下。 IL-4：上游5’-CGA GCT CAC TCT CTG TGG TG-3’，下游 5’-GAA CGA GGT CAC AGG AGA A-3’；IL-6：上游 5’-GCT GGA GTC ACA GAA GGA G-3’，下游 5’-GGC ATA ACG CAC TAG GTT T-3’；TNF-α：上游 5’-GCC AGC CGA TGG GTT GTA-3’，下游 5’-GGT TGA CTT TCT CCT GGT ATG-3’；磷酸甘油醛脱氢酶（reduced glyceraldehydes-phosphate dehydrogenase， GAPDH）：上游 5’-CTC ATG ACC ACA GTC CAT GC-3’，下游 5’-TTC AGC TCT GGG ATG ACC TT-3’。采用SYBR®GREEN染料法行qPCR反应，以2-ΔΔCt法计算目的基因相对于GAPDH的变化倍数作为目的基因表达的相对水平，以相对于空气-纯水组的变化倍数来比较组间差异。

1.8 统计学分析采用SPSS19.0软件进行统计学处理。正态分布计量数据采用±s表示，多组间连续计量资料的比较采用多因素方差分析，进一步的两两比较采用 LSD法。 P＜0.05为差异有统计学意义［13］。

2 结果

2.1 PM2.5对大鼠 BALF中炎症细胞因子含量的影响实验实施期间（2014-12-01／2015-02-28），暴露点 PM2.5测得的浓度值范围为 68.2 ～228.4 μg／m3，平均 127.6 μg／m3。 空气暴露实验实施 90 d，与空气-纯水组比较，PM2.5-纯水组大鼠 BALF 中 IL-4、IL-6 和TNF-α 的含量明显升高（P＜0.01）。 与 PM2.5-纯水组比较，PM2.5-喷雾组大鼠 BALF 中 IL-4、IL-6 和 TNF-α的含量明显下降（P＜0.01）。 空气-纯水组与空气-喷雾组之间比较，差异无统计学意义（P＞0.05，图1，表1）。

图1 PM2.5对大鼠BALF中炎症细胞因子含量的影响

表1 PM2.5对大鼠BALF中炎症细胞因子含量的影响（n＝10，±s，pg／mL）

表1 PM2.5对大鼠BALF中炎症细胞因子含量的影响（n＝10，±s，pg／mL）

bP＜0.01 vs PM2.5-纯水组。

组别 IL-4 IL-6 TNF-α空气-纯水组 112.11±39.21 231.51±49.21 252.64±45.33空气-喷雾组 106.56±33.82 196.84±43.17 226.31±52.16 PM2.5-纯水组 378.38±57.70 896.25±83.32 778.38±54.26 PM2.5-喷雾组 142.16±48.90b 272.30±38.90b 302.16±42.67b

2.2 PM2.5对大鼠肺组织中炎症细胞因子 mRNA 表达的影响空气暴露实验实施90 d，与空气-纯水组比较，PM2.5-纯水组大鼠肺组织中 IL-4、IL-6 和 TNF-α的 mRNA 表达水平明显升高（P＜0.01）。 与 PM2.5-纯水组比较，PM2.5-喷雾组大鼠肺组织中 IL-4、IL-6 和TNF-α 的 mRNA 表达水平明显下降（P＜0.01）。 空气-纯水组与空气-喷雾组之间比较，差异无统计学意义（P＞0.05，图 2）。

图2 PM2.5对大鼠肺组织中炎症细胞因子mRNA表达的影响

2.3 大鼠肺组织病理学改变空气暴露实验实施90 d，空气-纯水组、空气-喷雾组和 PM2.5-喷雾组大鼠肺组织结构正常。PM2.5-纯水组肺间隔增厚，肺间质大量炎症细胞浸润，肺泡间隔明显淤血（图3）。

图3 大鼠肺组织病理学改变

3 讨论

PM2.5颗粒物，又称“可入肺颗粒物”，主要通过呼吸道进入人体。值得注意的是，PM2.5也可通过吸附在皮肤的毛孔中，导致皮肤炎症，特别是携带脂溶性有毒物质的PM2.5颗粒更容易通过皮肤进入人体。流行病学研究表明，长期暴露于空气污染物中的人群，其死亡率与空气污染物的浓度呈正相关。空气中的病毒、细菌、灰尘和烟雾等PM2.5颗粒物均带正电，负离子空气净化器即通过产生生态负离子中和沉降空气中的PM2.5颗粒物。在此基础上，本课题组研发了一种防PM2.5喷雾，其基本原理是在皮肤表面形成静电场，通过静电排斥的作用减少PM2.5颗粒物通过呼吸和皮肤进入机体，发挥保护作用［11］。本研究选用PM2.5空气污染物所致的SD大鼠肺损伤模型，探讨这种防PM2.5喷雾对空气污染导致大鼠肺部炎症反应的保护作用。

研究［14-15］发现，成年小鼠 PM2.5颗粒物暴露后出现气道高反应性和以嗜酸性粒细胞、中性粒细胞浸润为主的炎症反应，同时IL-4分泌增加，而IFN-γ的表达水平无明显变化，影响Th1／Th2的动态平衡状态，从而导致免疫系统功能异常。Th2细胞的过度活化会释放大量的细胞因子，包括 IL-4、IL-6和 TNF-α等，加重气道炎症反应［13］。本研究结果证明，大鼠长期暴露于PM2.5较高的环境下会导致肺部慢性炎症，肺组织中炎症细胞因子长期处于较高水平，引起肺间隔增厚、肺间质大量炎症细胞浸润及肺泡间隔淤血。值得注意的是，尽管PM2.5-喷雾组的大鼠同样长期暴露于 PM2.5较高的环境，但是在使用防 PM2.5喷雾进行干预后，未见明显的肺组织病理学改变，而且在大鼠的肺组织和BALF中炎症细胞因子的表达水平与暴露于洁净空气的大鼠相比，没有明显的差异，处于正常水平。这一结果证明了防PM2.5喷雾可明显抑制肺部的炎症反应，对肺部发挥保护作用。鉴于PM2.5颗粒物暴露不仅可造成肺组织的损伤，而且可累及心血管系统、神经系统、甚至导致癌症的发生。因此，我们需要进一步明确防PM2.5喷雾的保护作用，为全方面预防PM2.5颗粒物对人体造成的危害提供理论依据和可行方案。