山西杓兰种子形态特征及萌发特性研究

谷娜 鞠志新 史春凤

【摘 要】 试验通过TTC染色、含水量测定、石蜡切片、萌发实验的方法，综合研究山西杓兰种子的形态特征及萌发特性。结果表明：山西杓兰染色率在48%-57%之间；平均含水量为32.67%；成熟种子的内部结构简单，有内外双层种皮，没有胚乳；胚体为球形胚；山西杓兰种子成熟状态下发芽率很低，通过不同的外界环境的刺激，相比未处理的种子发芽从0提率高到2.9%，其中GA3浓度和温度对种子发芽率的影响最大。通过对山西杓兰种子形态特征与萌发特性的研究，为合理有效的保护这一濒危物种提供科学依据。

【关键词】 山西杓兰；种子；生活力；含水量；形态特征；萌发特性

[Abstract] The morphological characteristics and germination characteristics of the seeds were studied by TTC staining， water content determination， paraffin section and germination experiment. The results showed that the dyeing rate was between 48% and 57%. The average moisture content was 32.67%； The inner structure of the mature seeds is simple， and there is no endosperm. The embryo is a spherical embryo； Shanxi mature state of wild flower seeds germination rate is very low， through the stimulation of different external environment， compared with the untreated seed germination rate from 0 to 2.9%， including GA3 concentration and temperature effect on the seed germination rate is the largest. Based on the study of the morphological characteristics and germination characteristics of the seeds of Shanxi， it provides a scientific basis for the reasonable and effective protection of this endangered species.

[Key words] cypripedium shanxiense S. C. Chen； seeds； life force； water content； morphological characteristics； germination characteristics

兰科杓兰属植物为陆生草本植物，有独特的囊状唇瓣，造型奇异，是具有很高的观赏和药用价值的物种。杓兰属植物自然繁衍能力较差且种子极小，地生兰种子的萌发十分困难，随着人们对野生兰花的过度采集，其野生种群处于严重濒危状态。山西杓兰被列为国家一级重点保护野生植物，观赏特性高而无法应用于园林生产。通过对山西杓兰种子形态特征与萌发特性的研究，为合理有效的保护这一濒危物种提供科学依据，也为该物種进一步研究提供基础资料，并且对山西杓兰的种苗繁育并应用于园林具有实践意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验种子于2013年采摘自吉林省通化市，一直低温储藏。所用试验仪器及药品有：切片机、显微镜、恒温箱、烘干箱等仪器，无水乙醇（95%）、冰醋酸、甲醛、二甲苯、明胶、甘油、固体石蜡、蕃红、固绿等药品，均由吉林农业科技学院园林实验室提供。

1.2 试验方法

1.2.1 种子生活力的测定 按常规方法配置1%TTC溶液，选取若干种子在40℃温水中浸泡，浸泡2d后，随机取3份种子，每份50粒，沿种胚中央切开，取每粒种子的一半备用。将种子放入带盖子的玻璃小瓶中，每瓶10mL TTC溶液，在20℃黑暗条件下染色3h，着色后将种子取出，用水冲洗干净，在尼康体视显微镜下观察种子染色情况，分别计算种子的染色率、未染色率、有胚率。

1.2.2 种子含水量的测定 采用直接烘干法测定种子的含水量。测定时取三次重复，分别测定格样品在80℃条件下烘干2h、4h、6h、8h、10h的干重。含水量（% ）=（M2-M3）/（M2-M1） ×100%，式中：M1培养皿的重量（g）；M2培养皿及样品的烘前重量（g）； M3培养皿及样品的烘后重量（g）。

1.2.3 制作石蜡切片 将种子在FAA固定液固定，将固定好的种子放入一系列系列浓度的酒精中逐级脱水，其顺序如下： 30%→50%→70%→85%→95%→100%→100%。脱水的种子放入酒精与二甲苯配比至纯二甲苯中进行透明，其顺序为：1/2酒精+1/2二甲苯（2h）→纯二甲苯（1h）→纯二甲苯（1h），放入37℃温箱中 24h 以上。再将材料浸入二甲苯∶石蜡=1∶1的溶液中，这个过程放入60℃温箱中经过3d后，改变混合液中二甲苯与石蜡的比例，分别从 1∶1→1∶2→纯石蜡→纯石蜡（每个过程3d）。迅速把材料按需要的切面及材料之间的间隔排列整齐，然后平放于冷水中，使其迅速凝固。待充分冷却凝固后，将包埋块修成梯形。利用切片机将材料切成厚度为 8μm 的连续切片。在清洁的载玻片上均匀涂上一层粘贴剂（粘贴剂为明胶黏贴剂），在上面滴上一滴蒸馏水，将切割好的材料放在上面，然后将载玻片放在恒温箱（42℃）中几十秒，待蜡带伸展平整后，移入 45℃的烘箱中干燥 24 h。将烘干后的带有材料的载玻片放入二甲苯中脱蜡，然后进行复水，其顺序如下：二甲苯→1/2酒精+1/2二甲苯→100%→95%→85%→70%→50%→30（每一步骤10min）。番红和固绿对染，其顺序为：1%的番红水溶液（12h）→30%乙醇（5min）→50%乙醇（5min）→70%乙醇（5min）→80%乙醇（5min）→0.5%固绿（40s）→100%乙醇（30s）→100%乙醇（5min）→1/2酒精+1/2二甲苯（5min） →二甲苯（5min）。染好色的切片用加拿大树胶封固。让其自然干固（或放入37℃温箱中烘1d）即制成永久切片。

1.2.4 种子发芽率的测定 根据温度、赤霉素浓度、光照时间设计3因素3水平正交试验， 试验在光照培养箱中进行，提供不同萌发条件。实验共12组，其中3组对照试验，每组去种子1000粒。所设计的正交试验表如表1。

2 结果与分析

2.1 种子的生活力

山西杓兰种子的染色率、未染色率、有胚率等生理性状如表1。山西杓兰种子蒴果，近梭形或狭椭圆形，种子极小，呈单粒分散状；供试种子开散，颜色为棕褐色，成熟开裂，肉眼不可观察。TTC染色后在显微镜下观察，未着色的种子，整个种皮被染成浅红色，种子内观察不到胚。而着色的种子，透过半透明的浅褐色种皮，能清楚地观察到染成红色的圆球形的胚。正常发育的种子大部分能染成深红色，颜色深浅会略有不同。三组试验有胚率分别为72%、89%、85%，相互之间差异不显著，平均有胚率为82%。染色率分别为48%、57%、53&，平均染色率为52.6%，三者之间差异不显著。未染色率则分别为52%、43%、47%。

2.2 种子的含水量

山西杓兰种子的含水量如表2。经过三次重复试验，得到结果如下：种子的含水量分别为27.41%、22.03%、48.57%，最高含水量为48.57%，平均含水量为32.67%。一般种子成熟时的安全含水量要低于12%才能达到安全临界含水量，山西杓兰成熟种子的含水量虽然为32.67%，但含水量不高，有利于种子成熟后在一段时期内保持活性。

2.3 种子的内部结构观察

制作成石蜡切片后在光学显微镜下观察种子内部胚结构，结果显示：山西杓兰的成熟的种子结构简单，有内外双层种皮，没有胚乳；胚体为球形胚；外珠被发育成的外种皮细胞形成纺锤形的轮廓， 内珠被发育成一层能被番红染色的致密的干膜质内种皮。内外种皮间是巨大的空气腔，有利于该微小种子成熟后的散布。图1种子横纵切面图（比例尺为100um）。

2.4 不同处理组合对种子发芽率的影响

不同的处理组合对山西杓兰种子萌发都具有促进作用，明显提高了发芽率和发芽率。从表3-3可以看出发芽率从0%提高到2.9%，其中光周期和温度对种子发芽率的影响最大，20℃、250㎎/l GA3、8h光照 16h黑暗的组合处理种子发芽率达到最高，为2.9%；25℃、500㎎/l GA3、8h光照 16h黑暗的处理组合发芽率也达到了2.6%。而20℃、125㎎/l GA3、12h光照 12h黑暗的处理组合发芽率也有2.1%。

3 结论与讨论

山西杓兰的种子蒴果，近梭形或狭椭圆形，种子极小，呈单粒分散状，种子在成熟时安全临界含水量高于12%，但是平均含水量为32.67%，说明种子含水量不高，有利于种子成熟后在一段时期内保持活性。TTC染色实验中，发现供试种子种皮薄，半透明浅褐色。未着色的种子，呈白色或整个种皮被染成浅红色；种子内观察不到胚。而着色的种子，透过半透明的浅褐色种皮，能清楚地观察到染成红色的圆球形的胚。在制作成石蜡切片试验中，成片后在光学显微镜下更能清晰的观察到种子的内部胚结构：成熟的种子结构简单，有内外双层种皮，没有胚乳；胚体为球形胚；外珠被发育成的外种皮细胞形成纺锤形的轮廓， 内珠被发育成一层能被番红染色的致密的干膜质内种皮。内外种皮间是巨大的空气腔，有利于该微小种子成熟后的散布。

TTC染色是通过化学反应间接手段测定种子的生活力，种子萌发实验是一种常规的、更为直接的种子生理活性测定方式。对山西杓兰成熟种子不同培养条件下进行萌发试验，结果表明山西杓兰成熟种子对照组的发芽率很低，在大花杓兰种子形态特征与生活力测定中， 成熟种子无菌播种实验，萌发率为零。为了提高种子的发芽率，试验通过改变外界环境条件，如温度、光周期、GA3浓度等，对山西杓兰种子进行刺激，其中光周期和温度对种子发芽率的影响最大，20℃、250㎎/L GA3、8h光照 16h黑暗的组合处理种子发芽率达到最高，为2.9%；25℃、500㎎/L GA3、8h光照 16h黑暗的处理组合发芽率也达到了2.6%；而20℃、125㎎/L GA3、12h光照 12h黑暗的处理组合发芽率也有2.1%。相比未处理的种子发芽率从0%提高到2.9%，虽然发芽率还不是很高，但还是一定程度上提高了种子的发芽率。

参考文献：

[1] 陈丽飞，刘树英，江鹏道，等.杓兰属植物研究进展[J].湖北 农业科学，2012，51（9）.

[2] 郎楷永.中国的杓兰[J].科技导报，2003，（1）：23- 29.

[3] 李冀云，王庆礼，秦忠时，等.东北植物检索表[M].北京：科 学出版社，1995：892-895.

[4] 黄家林，胡虹.黄花构兰种子无菌萌发的培养 条件研究[J]. 云南植物研究2001，23（l）：105-108.

[5] 宋松泉，程紅焱，姜孝成，等.种子生物学[M].北京：科学出版 社， 2008： 15-16.

[6] 张毓，张启翔，赵世伟，等.大花杓兰种子形态特征与生活力 测定[J].北京林业大学学报，2010，32，（1）：69-73.