超高效液相色谱法检测猪肉及其制品中的磺胺类及氟喹诺酮类兽药残留

滕爽，吕青骎，沈娟，包月红，汤晓燕，王玮*

1(南京农业大学，国家肉品质量安全控制工程技术研究中心,农业部肉及肉制品质量监督检验测试中心(南京)，江苏 南京，210095) 2(中国农业科学院 农业质量标准与检测技术研究所，北京，100081)

磺胺类药物(sulfonamides, SAs)和氟喹诺酮类药物(fluoroquinolones, FQs)作为广谱抗菌药，主要用于预防和治疗畜禽的感染性疾病，这两类兽药性质稳定、品种多、产量大、价格低、使用简便，在兽医临床和畜牧养殖业中作为饲料添加剂或动物疾病治疗药物被广泛使用[1-2]。但在人工饲养过程中，如不当或超量使用这些药物，会导致其残留在动物性食品中，给人类健康带来危害。因此，动物性食品中的兽药残留问题引起了国内外的广泛关注[3]。目前，我国对磺胺类和氟喹诺酮类药物在动物体内残留也有相应的限量规定[4]，如磺胺类在动物食品的肌肉、脂肪、肝、肾组织中总量不得超过100 μg/kg；恩诺沙星在肌肉中的限量为100 μg/kg。

目前，动物性食品中SAs或FQs兽药残留量的检测方法主要有毛细管电泳法[5-6]、免疫法[7-9]、高效液相色谱法[10-15]以及液相色谱-质谱法[16-19]等。其中，毛细管电泳法分离效率高，但重现性差；免疫法检测速度快、灵敏度高、选择性强，但一般只作为辅助手段；高效液相色谱法应用广泛，但分析时间长，有机溶剂使用量大；液相色谱-质谱法可实现多种物质的同时分析，但仪器价格较为昂贵。超高效液相色谱法(ultra-performance liquid chromatography, UPLC)作为一种基于超高压系和小颗粒填料色谱柱的新型的液相色谱技术，其结合后可明显提高检测灵敏度以及色谱峰的分离度，缩短样品的检测周期，还可实现分离难度大的复杂体系的快速分析，但其价格却远低于液质联用仪，这使得UPLC法在药物分析、食品分析等领域备受关注[20-21]。为此，本试验通过优化前处理方法和仪器检测条件，建立了一种UPLC技术同时检测猪肉中的9种磺胺类和3种氟喹诺酮类药物的方法，弥补常规检测方法的缺陷，以期为我国动物性食品中兽药残留的高通量快速检测以及食品安全法的顺利实施提供可靠的科学支持和坚实的技术保障。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试材料为各种市售猪肉及制品，如生鲜猪肉、香肠、火腿肠、卤肉等样品，均购自南京农贸市场和超市。

标准品：磺胺醋酰(sulphacetamide, SA)、磺胺噻唑(sulfathiazol, ST)、磺胺二甲基嘧啶(sulfamethazine, SM2)、磺胺甲氧哒嗪(sulfamethoxazole, SMP)、磺胺间甲氧嘧啶(sulfamonomethoxine, SMM)、磺胺甲恶唑(sulfamethoxazole, SMZ)、磺胺二甲异恶唑(sulfisoxazole, SIZ)、磺胺二甲氧哒嗪(sulfadimethoxine, SDM)、磺胺喹噁啉(sulfamethoxazole, SQ)、环丙沙星(ciprofloxacin, CIP)、恩诺沙星(enrofloxacin, ENR)、沙拉沙星(sarafloxacin, SAR)，均购自德国Dr. Ehrenstorfer公司；乙腈(色谱纯)、甲醇(色谱纯)，购自美国Fisher公司；磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)(分析纯)、磷酸二氢钾(KH2PO4)(分析纯)，购自上海安谱实验科技股份有限公司；InerSep HLB小柱(200 mg/6mL)，购自日本岛津公司；试验中用水均为一级水。

1.2 仪器与设备

ACQUITY H-Class超高效液相色谱仪(配有PDA、FLR检测器)、ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱，美国Waters公司；advance EDI纯水仪、CPA224S电子天平、D-16C高速离心机，德国Sartorious公司；XS-105电子天平，瑞士Mettler-Toledo公司；HS 501数显型混匀器，德国IKA公司；N-EVAP 24管氮吹仪，美国Organomation公司；VISIPREP 24TMDL固相萃取装置，美国Supelco公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品的前处理

(1)提取：称取2 g K2HPO4·3H2O和8 g KH2PO4，一级水溶解并定容至1 000 mL，该溶液作为提取液(pH 6)。将样品制成肉糜，准确称取2.0 g样品，置于50 mL离心管中，加入8 mL提取液，涡旋混匀，振荡器振荡30 min，8 000 r/min离心10 min，将上清液转移至另一50 mL离心管中，在离心沉淀物中加入8 mL提取液，重复以上步骤，并将2次提取的上清液合并，混匀。

(2)净化：将HLB小柱置于固相萃取装置上，5 mL甲醇和5 mL水活化平衡SPE固相萃取柱，将提取液上样，分别用5 mL水和5 mL 20%甲醇水溶液清洗，真空抽干，用5 mL甲醇-乙酸乙酯-氨水(体积比49∶49∶2)洗脱，收集洗脱液，40 ℃下氮气吹干，20%甲醇水溶液定容至1 mL，涡旋30 s，过0.22 μm微孔滤膜，取10 μL进行UPLC分析。不称取试样，按上述步骤进行试剂空白试验；使用阴性肉糜，按上述步骤进行空白试验；在阴性肉糜中加入标准混合液，按上述步骤进行阳性添加试验。

1.3.2 标准溶液的配制

单标储备液的配制：分别称取100.0 mg 9种磺胺和3种氟喹诺酮的标准品，甲醇稀释，定容到100.00 mL容量瓶中，配制成质量浓度为1.00 mg/mL的标准储备液。

两类兽药混合标准液的配制：分别移取一定量的单标溶液并用甲醇定容，9种磺胺混合标准液质量浓度均为10.0 μg/mL，3种氟喹诺酮混合标准液质量浓度均为1.00 μg/mL。

混合工作液的配制：移取一定量的混和标准液，20%甲醇水溶液定容，磺胺质量浓度梯度为0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 μg/mL，氟喹诺酮质量浓度梯度为0.001、0.005、0.01、0.02、0.05、0.2 μg/mL。

1.3.3 UPLC法的建立

ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，流动相为乙腈和0.1%甲酸水溶液，流速为0.2 mL/min，紫外检测波长280 nm，荧光检测激发波长λex=280 nm、发射波长λem=450 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL，梯度洗脱，同时检测两类兽药，梯度洗脱条件见表1。

1.3.4 检出限、定量限及线性范围的确定

参照1.3.3节将标准混合工作溶液上机测定，本试验以3倍信噪比(S/N=3)计算检出限(LOD)，10倍信噪比(S/N=10)计算定量限(LQD)。线性范围最低点设定为出峰良好的最低浓度，最高点设定至超过国家限量浓度。磺胺线性范围为0.01～1.0 μg/mL，氟喹诺酮线性范围为0.001～0.200 μg/mL，共设定6个浓度点，以标准工作液质量浓度(μg/mL)作为横坐标(X)，峰面积(μV×s)作为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，计算平方相关系数(square of correlation coefficient,R2)。

1.3.5 准确度和精密度试验

将阴性生鲜猪肉制成肉糜，分别添加3个水平的磺胺类和氟喹诺酮类混合标准液，磺胺类添加量为20、40、100 μg/kg，氟喹诺酮类添加量为2、4、10 μg/kg，每个添加浓度平行测定6个样品，计算回收率(recovery)，得到本方法的准确度，根据平行样品的结果，计算相对标准偏差(relative standard deviations，RSD)，得到本方法的精密度。

1.3.6 方法的实际应用

选用市售猪肉及其制品14份，其中生鲜肉7份，肉制品7份，其样品前处理和检测方法参照1.3.1和1.3.3，以此来评价该方法的实际应用效果。

1.4 数据分析

使用Empower 3(美国Waters公司)软件分析数据，使用Microcal Origin 7.5(Microcal Software公司)软件制图。阳性添加试验均平行测定6次，计算RSD。样品检测平行测定2次，计算平均值。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的选择

磺胺类药物在荧光检测器上无响应，在紫外检测器响应好；氟喹诺酮类在紫外和荧光检测器上均有响应，但荧光检测器上比紫外检测器灵敏度高。本试验采用紫外串联荧光检测器的方法，所有目标物响应高、峰型好、达到良好的分离度，可以降低方法检出限。通过单标的保留时间对每个色谱峰定性，确定12种目标物的出峰时间及顺序。9种磺胺及3种氟喹诺酮的标准品色谱图如图1和图2所示。图1中9种磺胺质量浓度为0.5 μg/mL，图2中3种氟喹诺酮质量浓度为0.05 μg/mL，色谱峰上端标注标准色谱峰名称和保留时间。

图2 3种氟喹诺酮混合标准品色谱图Fig.2 Chromatogram of 3 kinds of fluoroquinolones standards

2.2 标准曲线的线性，检出限和定量限

本试验采用外标法绘制标准曲线，12种标准物质的线性方程、相关系数、检出限和定量限见表2。磺胺类兽药在0.01～1.00 μg/mL，氟喹诺酮类兽药在0.001～0.200 μg/mL范围内呈现出良好的线性关系，其相关系数均可达到0.999以上。磺胺类检出限为1.2～3.5 μg/kg，定量限为4.0～11.7 μg/kg，氟喹诺酮类检出限为0.12～0.5 μg/kg，定量限为0.4～1.7 μg/kg。

表2 9种磺胺及3种氟喹诺酮线性范围、线性方程、平方相关系数、检出限和定量限Table 2 Linear range, linear equation, square of correlation coefficient, LOD and LOQ of 9 sulfonamides and 3fluoroquinolones

2.3 准确度与精密度

将不同质量浓度的标准液添加至阴性猪肉糜中，制备不同添加浓度的样品，采用UPLC法检测样品中兽药残留的回收率及相对标准偏差(RSD)，每个浓度平行测定6样。结果(表3)显示：3个不同浓度水平加标回收率在70.0%～98.0%，RSD为1.09%～4.64%，RSD小于5%，这表明该方法准确度高、精密度好，可以满足肉及肉制品中的磺胺类和氟喹诺酮类兽残检测。

2.4 方法的实际应用

为证实本方法的实际应用价值，选取16份市售猪肉及其制品为研究对象，其中1号样品(阴性对照)和2号样品(阳性添加)作为本试验的质量控制样品。试验结果(表4)表明：在14份样品中，3种氟喹诺酮均未检出，但有样品检出磺胺类药物残留，例如：3号猪肉样品中检出SIZ 17.5 μg/kg；4号猪肉样品中检出SMM 11.0 μg/kg；6号猪肉样品中检出SIZ 33.0 μg/kg、SDM 31.0 μg/kg；9号猪肉样品中检出SDM 13.5 μg/kg；在10号香肠样品中检出SM250.0 μg/kg、SMM 19.0 μg/kg、SIZ 24.0 μg/kg，11号火腿肠中检出SM277.5 μg/kg，12号卤肉样品中检出SM259.0 μg/kg、SMM 38.0 μg/kg，13号卤肉样品中检出SM231.0 μg/kg、SMZ 49.5 μg/kg、SDM 11.5 μg/kg，15号卤肉样品中检出SMM 19.0 μg/kg、SQ 14.0 μg/kg。

3 结论

表3 加标回收率和相对标准偏差(n=6)Table 3 Spiked recovery and relative standard deviation(n=6)

表4 市售肉及肉制品磺胺类和氟喹诺酮类兽残检测结果Table 4 Detection results of sulfonamides and fluoroquinolones in meat and meat products

注：“-”为未检出，“+”为检出 。

超高效液相色谱法具有峰形良好、溶剂使用量小、分析时间短、检出限低等优点，文献表明UPLC法测定畜禽肉中的磺胺类兽药残留，检出限可以达到2～6 μg/kg[21]。本试验采用UPLC紫外检测器串联荧光检测器同时检测猪肉中的9种磺胺类和3种氟喹诺酮类药物，所有检测目标物分离良好，磺胺类检出限为1.2～3.5 μg/kg，氟喹诺酮类检出限为0.12～0.50 μg/kg，该检出限低于现行有效检测方法GB 29694—2013以及农业部1025号公告-14-2008中磺胺类5 μg/kg[14]和氟喹诺酮类20 μg/kg[15]。低、中、高3个浓度水平加标回收率在70.0%～98.0%，RSD均小于5%，表明该方法具有高准确度和高精密度。该方法应用于猪肉及其制品的检测，达到了良好的检测结果，可应用于畜肉及其制品的磺胺类及氟喹诺酮类兽药残留的高通量快速检测。