顶空固相微萃取结合气相色谱质谱-嗅闻联用技术鉴定巧克力麦芽中可可特征风味物质

秦奔，张海鹏，郑飞云，钮成拓，刘春凤，王金晶，李永仙，李崎

(江南大学 生物工程学院，工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡，214122)

麦芽是啤酒生产的主要原料之一，不同种类的麦芽生产出的啤酒在风味、口感以及颜色上都会有所差异[1]。巧克力麦芽因其特殊的风味和颜色，对啤酒品种的增加和丰富具有很好的作用[2]。麦芽的风味形成是个复杂的过程，通过美拉德反应以及焦糖化等作用，产生风味物质[3-5]，成品麦芽呈巧克力褐色，业界将具有700～1 300 EBC色度且具有类似巧克力风味的麦芽统称为巧克力麦芽[6]。可可是制作巧克力的原料，由于巧克力是经过加工后的产品，风味差异较大，所以一般以可可风味来代表巧克力风味。在啤酒酿造过程中，添加少量的巧克力麦芽就能给成品啤酒带来独特的色泽，并且具有坚果、咖啡或巧克力可可的风味特征[7-9]，除此之外，巧克力麦芽还被应用于其他食品的生产[10]。

通过气相色谱-质谱联用(gas chromatography-olfactometry-mass spectrometer,GC-MS)技术能够对挥发性物质进行检测与定量[11-12]，但该技术无法感知气味与风味强度。本文选用气相色谱质谱-嗅闻联用(gas chromatography-olfactometry-mass spectrometer, GC-O-MS)技术，在GC-MS的基础上，连接一个嗅闻装置，以人的嗅觉为检测器，对风味进行描述，并且感知风味强度。由于GC-O-MS具有的感知气味，以及时间-强度法实验操作次数少，能够快速推断样品中的主要特征风味物质等优点，使得GC-O-MS技术在香精、食品等领域应用广泛[13]。本研究选用顶空固相微萃取(headspace-solid phase micro-extraction,HS-SPME)技术结合气相色谱-质谱-嗅闻联用(GC-O-MS)分析并鉴定巧克力麦芽中的可可特征风味物质，能够为巧克力麦芽的定义、深入研究以及指导生产提供理论性参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

麦芽：浅色麦芽(加拿大麦芽)，购自中粮麦芽(江阴)有限公司；巧克力麦芽1号(美国)，购自上海金啤食品原料有限公司；巧克力麦芽2号(乐斐)、焦香麦芽、黑麦芽，购自新西兰Gladfield公司；巧克力麦芽3号(维耶曼)、巧克力麦芽4号(比利时)、巧克力麦芽5号(比利时城堡)、巧克力麦芽6号(欧麦)，市售麦芽。

标样：2,6-二甲基吡嗪(99%，Adamas)，三甲基吡嗪(99%，Adamas)，2-乙基-3,5-二甲基吡嗪(95%，Aldrich)，2-甲氧基-3-甲基吡嗪(99%，Aladdin)。

1.2 仪器与设备

DLEUW22050麦芽粉碎机，Buhler-Miag公司；气相色谱质谱联用仪(GCMS-QP2010)，日本岛津(Shimadzu)公司；嗅觉检测器，德国Gerstal公司；SPME手动进样器、萃取纤维头2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS、20 mL具塞顶空瓶，美国Supelco公司。

1.3 实验方法

1.3.1 实验条件

1.3.1.1 色谱条件

色谱柱：DB-WAX(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；升温程序：45 ℃保持1 min，以6 ℃/min速度上升到230 ℃，保持6 min；载气为He气，流速1.5 mL/min；进样口温度250 ℃，解吸时间1 min；不分流。

1.3.1.2 质谱条件

离子源EI源；离子源温度：200 ℃；四级杆温度：150 ℃；电子能量：70 eV，扫描质量范围33～400 u；进样条件：手动进样。

1.3.2 样品预处理以及SPME提取方法

取低温下保存的麦芽样品10 g，用粉碎机粉碎，精确称取3.00 g麦芽细粉倒入20 mL具塞顶空瓶中，加盖密封，在60 ℃水浴中平衡10 min，然后用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头在具塞顶空瓶中上部吸附萃取50 min，在气相色谱进样口250 ℃进行解吸，解吸时间1 min。

1.3.3 GC-O分析方法

在毛细管柱出口处连接嗅闻装置，质谱和嗅闻装置分流比为1∶1。实验之前，选定实验室感官评定小组中3个经过风味训练、并有一定经验的研究人员作为感官品评员进行GC-O嗅闻实验。实验过程中，在同一嗅闻风味出峰点，至少需要有两位感官评定员嗅闻得到相同的感官描述，才能记入最终的结果。感官评定员不仅要对物质的香气进行描述，还要确定风味化合物的香气强度。实验选择5分制来进行香气强度的评价，即“0”表示没有香气，“1”表示香气微弱，“2”表示香气较弱，“3”表示香气中等，“4”表示香气较强，“5”表示香气很强，有刺激性味道。

1.3.4 化合物定性方法

风味物质经过质谱仪分析得到的数据通过NIST标准谱库检索，选择匹配度最高的鉴定结果，并在相同色谱条件下，通过对C6～C30正构烷烃的色谱扫描，计算得到各化合物的保留指数(retention index，RI)值，与相应的文献值[14]进行对照，同时，经过感官评定员嗅闻描述的化合物香味特征与文献报道结果对比，验证定性结果。

1.3.5 OAV值的计算方法

1.3.5.1 标准曲线的制作

将3种吡嗪类化合物标样配置成混标，并稀释成10、50、100、500、1 000 μg/L的质量浓度梯度，以50 μg/L的2-甲氧基-3-甲基吡嗪作为内标物质进行校正，取5 mL混标以及50 μL的内标溶液进行GC-MS检测，并以各标样浓度为横坐标，吡嗪类化合物与内标的峰面积比值为纵坐标，分别做标曲。

1.3.5.2 三种吡嗪类物质的定量检测

取低温下保存的麦芽样品10 g，用粉碎机进行粉碎，精确称取5.00 g的麦芽细粉，溶于100 mL水中，45 ℃下浸提30 min，升温至70 ℃浸提60 min，取5 mL浸提液以及50 μL的内标溶液，采用内外标法进行GC-MS定量检测。

1.3.5.3 OAV的计算方法

根据内外标法对麦芽中的香气成分的定量检测结果以及各物质的香气阈值，按式(1)计算OAV值。

(1)

式中：C,根据内外标法得出的该化合物的质量浓度,μg/kg；OT,该化合物的嗅觉阈值,μg/kg。

2 结果与讨论

2.1 巧克力麦芽1号样品GC-O-MS分析

通过GC-O-MS技术对市售麦芽样品巧克力麦芽1号的风味物质进行了检测与分析，共检测得到47种挥发性化合物，包括14种醛类、7种醇类、5种酮类、5种酸类、6种吡嗪类以及其他一些特殊的风味物质。其总离子流图谱见图1，并对各种风味物质进行香气描述，记录其风味强度，其检测结果如表1所示。

图1 巧克力麦芽1号总离子流图Fig.1 The total ion flow diagram of chocolate malt 1

由于挥发性风味物质之间存在叠加、协同的作用，多种风味化合物共同构成了麦芽的风味。根据不同风味物质的香气强度，能够判断出单一风味物质对麦芽整体风味的贡献度，同时，根据对风味化合物的感官描述，能够找出具有不同风味特征的物质[15]。表1显示了巧克力麦芽1号所检测出的47种风味物质的保留时间、化合物名称、匹配度、风味描述、风味强度、峰面积以及峰面积百分比。其中11种风味化合物的气味明显(风味强度>3)，对巧克力麦芽风味组成贡献较大，分别是3-甲基丁醛(麦芽香)、庚醛(奶油脂香)、2,6-二甲基吡嗪(可可香)、三甲基吡嗪(可可香)、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪(可可香)、醋酸(酸味)、糠醛(杏仁、焦糖香)、菠萝酮(焦糖香)、顺式-5-甲基-2-异丙基-己烯醛(坚果、花生)、2-乙酰吡咯(烤面包)、麦芽酚(焦糖香)，其中具有可可特征风味(可可香)的化合物有三种，它们对巧克力麦芽中的可可风味贡献最大，分别为2,6-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪。

表1 GC-O-MS测定巧克力麦芽1号中挥发性风味化合物Table 1 Determination of volatile flavor compounds in chocolate malt I by GC-O-MS

注：嗅闻强度中， “1”表示香气微弱，“2”表示香气较弱，“3”表示香气中等，“4”表示香气较强，“5”表示香气很强，有刺激性味道。

2.2 可可特征风味物质的鉴定

2.2.1 三种吡嗪类物质的性质

3种吡嗪类物质同属于烷基吡嗪类，2,6-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪天然存在于肉、可可、咖啡等食品中，而2-乙基-3,5-二甲基吡嗪天然存在于炒花生、咖啡、炒大麦及爆米花等中，食品中这3种吡嗪类物质都是在焙烤、炒制过程中通过美拉德反应等作用产生的，并且这3种吡嗪类物质都是国标中允许使用的食品香精，主要用于配制巧克力、咖啡、烤坚果等香精[16]。

2.2.2 与可可粉的比较与分析

由文献可知，可可粉中具有的可可特征风味物质有3种，分别是2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪以及2,3,5,6-四甲基吡嗪[17]，在可可加工和巧克力制品中都是重要的特征性风味物质。其中，2,5-二甲基吡嗪与2,6-二甲基吡嗪互为同分异构体，出峰时间相近，实验检测中可能出现风味掩盖的现象。而2,3,5,6-四甲基吡嗪在本实验中未能检测到。由于巧克力麦芽与可可粉的原料以及生产工艺存在差异，而巧克力麦芽只是具有类似可可、巧克力的风味，所以巧克力麦芽的可可特征风味物质并不一定与可可粉完全相同。

2.2.3 不同麦芽样品吡嗪类物质的比较与分析

由文献可知，特种麦芽中所具有的可可、咖啡、坚果以及烘烤味等风味一般是由烷基吡嗪类化合物产生的[18-19]，与本文GC-O结果相符。在焙烤过程中，吡嗪类物质通过美拉德反应等作用产生[20]，其含量随着焙烤程度的加深先增加后减少，呈钟形变化[21]。为了验证在不同的巧克力麦芽样品中是否都具有2,6-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪这三种吡嗪类物质，选择国内外市场上常见的6种品质优良的巧克力麦芽样品以及浅色麦芽、焦香麦芽和黑麦芽样品，对吡嗪类物质种类进行了比较与分析，其结果如表2所示，“ND”表示未检测出。

表2 不同麦芽样品中吡嗪类物质分析Table 2 Analysis of pyrazines in different malt samples

由表2可知，巧克力麦芽1号样品中的12种吡嗪类物质，几乎都可以在其他5种巧克力麦芽样品中检测到，而在浅色麦芽中几乎检测不到吡嗪类物质，在焦香麦芽以及黑麦芽中吡嗪类物质种类较少、含量较低，说明巧克力麦芽与其他种类麦芽的吡嗪类物质种类及相对含量都有明显的差异。实验结果表明，巧克力麦芽的焙烤程度处于烷基吡嗪类物质生成量较高的时期，由于这3种吡嗪类物质都是在焙烤过程中产生的，并且产品原料都来自于大麦，可以确定在巧克力麦芽中都具有这三种吡嗪类物质，其主要差异在于物质的含量。

2.2.4 麦芽样品中吡嗪类物质的香气阈值及香气活度值(OAV)

巧克力麦芽中吡嗪类物质虽然含量较低，但是由于其风味阈值极低，所以吡嗪类物质对麦芽风味的贡献很大。对麦芽样品中3种吡嗪类物质进行了定量检测与分析，其线性关系、香味阈值以及OAV值如表3所示。

表3 麦芽样品中三种吡嗪类物质的线性关系、香气阈值以及OAV值Table 3 The odor threshold, linearity and OAV of three pyrazines in the sample of Malt

注：a各物质在葵花油中测定的香气阈值；b各物质的OAV值均保留两位小数；c嗅觉阈值数据来源于文献[22]；d嗅觉阈值数据来源于文献[23]。

由于麦芽基体中的吡嗪类物质的香气阈值并未报道，所以本文统一选用葵花油中测定的香味阈值[22-23]。将5.00 g粉碎后的麦芽经浸提后，再通过GC-MS技术进行定量检测，计算得到OAV值。表3结果表明，巧克力麦芽中，2,6-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪这3种吡嗪类物质的OAV值都大于1，对整体香气的贡献较大。

3 结论

本论文采用顶空固相微萃取技术结合GC-O-MS技术，分析并鉴定了巧克力麦芽样品中的可可特征风味物质，并通过OAV值以及与其他样品麦芽的比较进行验证。结果表明，在这类巧克力麦芽中，具有巧克力可可特征风味的化合物有3种，对巧克力麦芽的可可风味贡献较大，分别为2,6-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪。本研究所得到的结论也将为巧克力麦芽的定义、研究以及生产提供理论性参考依据。由于巧克力麦芽原料、制麦及焙烤生产过程中的不稳定性，导致巧克力麦芽的生产质量与风味品质无法得到保证，因此巧克力麦芽制作过程中的物质变化、条件控制以及风味稳定性将作为以后研究的重点问题。