玉米醇溶蛋白-阿拉伯胶纳米颗粒的制备及性质表征

许雪儿，李娟，陈正行*，王涛，王韧，王莉，罗小虎

1(江南大学 食品学院，江苏 无锡，214122)2 (江南大学 粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏 无锡，214122)

我国玉米年产量高达2.153亿t，其中近两成用于制备玉米淀粉，在淀粉提取过程中所得分离产物玉米蛋白因其蛋白质组成不符合人体必需氨基酸组成需求而不被利用，其中玉米醇溶蛋白(zein)占据60%[1]。zein作为生物大分子其疏水氨基酸含量较高，溶于35%～90%乙醇而不溶于水和无水乙醇，利用zein特有的两亲性和独特溶解性，能够有效制备纳米颗粒，但因稳定性较差，影响了应用[2]。阿拉伯胶(arabic gum，AG)是一种天然阴离子多糖，其结构上带有部分蛋白物质及鼠李糖，若能通过静电相互作用与zein有效结合，则可提高zein在水中的溶解性，并提高对酸碱盐的耐受性[3]。生育酚(tocopherol，TOC)作为抗氧化性很强的功能性营养物质因其不稳定性限制了在人体内的有效输送，通过制备所得zein-AG纳米颗粒对TOC进行高效负载，达到缓释效果[4]。制备zein纳米颗粒时在亲水胶体的选择上前人多选择果胶等进行研究，王丽娟等[5]研究果胶复合zein并负载姜黄素，结果表明果胶的加入有利于提高纳米颗粒的稳定性和姜黄素的抗氧化性，但对于AG的研究甚少，且未见有关于不同zein初始储备液浓度、不同醇水比对形成纳米颗粒的影响的研究报道，而在实际制备中，以上都是极为重要的影响因素。石燕等[6]研究AG复合乳清蛋白制备微胶囊壁材，制得的壁材在稳定性和韧性等方面均高于单纯的乳清蛋白壁材。

本文通过反溶剂法结合AG制备负载TOC的zein纳米颗粒，研究zein储备液质量浓度、体系中乙醇与水体积比(醇水比)、pH值、盐离子浓度对纳米颗粒稳定性影响，并对负载TOC的比例和包封率进行了探究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米醇溶蛋白，河南华瑞生物科技有限公司；阿拉伯胶、α-生育酚，美国Sigma试剂公司；AR级NaOH、HCl、无水乙醇、石油醚,上海国药集团。

1.2 仪器与设备

磁力搅拌器，德国IKA仪器有限公司；Himac CR21G型冷冻干燥机，日本 HITACHI 公司； Zetasizer Nano ZS纳米粒度电位仪，英国Marlven仪器公司；WFZ UV-2000型紫外可见光分光光度计，尤尼柯上海仪器有限公司；LXJ-IIB型低速台式离心机，中国上海安亭科学仪器厂；DHG-9101·3SA型电热恒温鼓风干燥箱，中国上海三发科学仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 纳米颗粒制备

称取0.5 g zein溶解于10 mL体积分数为80%的乙醇中，磁力搅拌30 min作为zein储备液；称取2 g AG溶解于10 mL去离子水中，磁力搅拌1 h得到AG储备液；量取800 μL zein储备液呈细流状移至38.9 mL的去离子水中，随后移取300 μL AG储备液至去离子水中(zein与AG质量比为1∶1.5，前期实验所得最优比例)，磁力搅拌60 min后4 000 /min离心10 min后取上清液得zein-AG纳米颗粒[7]。

1.3.2 不同zein储备液浓度下纳米颗粒粒径、电位、多分散指数(polydispersity index，PDI)测定

分别称取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 、0.6、0.7 g zein溶解于10 mL体积分数为80%乙醇中，磁力搅拌30 min作为质量浓度为10、20、30、40、50、60、70 g/L(质量浓度)的zein储备液，随后按照zein与AG质量比为1∶1.5加入zein、AG并调节纳米颗粒pH=4，其他步骤同1.3.1；所得纳米颗粒稀释至10倍，分散均匀后取1 mL放入样品池后进行测定[8]。

1.3.3 不同醇水比下纳米颗粒粒径、电位、PDI测定

取不同体积zein的乙醇储备液与样品中水体积比为1∶50、1∶40、1∶30、1∶20、1∶10、1∶5，调节并固定纳米颗粒pH=4，其他步骤同1.3.1(zein与AG质量比为1∶1.5)。

1.3.4 不同pH值下纳米颗粒粒径、电位、PDI测定

用pH=3～9的磷酸盐缓冲液分别对样品进行pH调控。取1 mL新鲜制备的不同pH值的zein-AG纳米颗粒稀释至10倍，分散均匀后取1 mL放入样品池后进行测定。

1.3.5 不同盐离子摩尔浓度下纳米颗粒粒径、电位、PDI测定

移取10 mL新鲜制备的纳米颗粒，加入10 mL不同盐离子摩尔浓度(0～100 mmol/L)溶液搅拌均匀后静置30 min。取1 mL新鲜制备的含不同盐离子摩尔浓度的zein-AG纳米颗粒稀释至10倍，分散均匀后取1 mL放入样品池后进行测定。

1.3.6 扫描电镜

将最优条件下所制得纳米颗粒经旋蒸除去乙醇后放入冷冻干燥机中冻干得固体样品，取少许样品放置于导电胶上固定后喷金，采用电子束对样品进行微观形貌拍摄，探针电压为30 kV, 电流为50 pA，电子束加速电压为5 kV, 放大倍数为20 000倍[9]。

1.3.7 负载TOC的纳米颗粒制备

称取0.5 g zein溶解于10 mL体积分数80%乙醇中，磁力搅拌30 min作为zein储备液，称取2 g AG溶解于10 mL去离子水中，磁力搅拌1 h得到AG储备液；量取800 μL zein储备液，并加入相应体积TOC，磁力搅拌30 min以充分溶解(按照zein-AG与TOC质量比1∶1、1∶2、1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50)得负载TOC的zein储备液；取800 μL TOC-zein储备液呈细流状移至38.9 mL的去离子水中，随后移取300 μL AG储备液至去离子水中(zein与AG质量比为1∶1.5，前期实验所得最优比例)，磁力搅拌60 min后4 000 /min离心10 min 后取上清液得TOC-zein-AG纳米颗粒。

1.3.8 不同zein-AG与TOC质量比纳米颗粒粒径、电位、多分散指数(PDI)测定

制备不同zein-AG与TOC质量比(1∶1、1∶2、1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50)的纳米颗粒，取1 mL新鲜制备的不同TOC含量的zein-AG纳米颗粒稀释至10倍，分散均匀后取1 mL放入样品池后进行测定。

1.3.9 TOC包封率测定

zein-AG纳米颗粒对生育酚包封率测定：移取5 mL负载生育酚的纳米颗粒、3 mL石油醚置于烧杯中，置于磁力搅拌器上搅拌60 min萃取得游离的生育酚，用0.22 μm有机膜过滤，重复萃取3次，合并萃取液，用石油醚稀释至10倍，以石油醚作为空白对照，在 298 nm下测定样品的吸光值，根据TOC在石油醚中的标准曲线方程：y=0.007 8+0.009，R2=0.995，算出游离生育酚含量后，按照式(1)计算包封率[10]：

(1)

2 结果与分析

2.1 不同zein储备液质量浓度下zein-AG纳米颗粒粒径、PDI、电位值

如图1-a所示，随着zein储备液质量浓度的升高，10～5 g/L内粒径无显著性变化，维持在125 nm，PDI均在0.3以下；高于50 g/L时，粒径显著上升，达到200 nm左右，PDI也上升至大于0.3；如图1-b所示，随着zein初始储备液浓度的升高，电位变化与粒径均向不稳定趋势变化，即10～50 g/L内电位在-32 mV左右无显著性变化，zein储备液质量浓度高于50 g/L时，电位显著增大，但仍小于-25 mV；zein储备液浓度较低时，zein分子充分分散到水相中，体系较为稳定；当zein在80%乙醇中浓度过高时，溶解的zein达到饱和状态，部分过剩的zein分子影响其反溶剂制备过程中纳米颗粒的粒径和PDI值。该结果与王丽娟[11]、FU等[12]研究果胶复配zein纳米颗粒时提出的zein初始储备液质量浓度过高影响纳米颗粒粒径的假设结果一致。由图1可知，制备zein-AG纳米颗粒时，应选取5 g/L的zein储备液质量浓度，既能够有效提高制备效率，又不对粒径、电位等指标产生负面影响。

图1 不同质量浓度zein储备液下zein-AG纳米颗粒粒径、PDI、电位对比图Fig.1 The effect of the different concentrations of zein in the particle size, PDI, zeta- potential of the zein-AG nanoparticles

2.2 不同醇水比下zein-AG纳米颗粒粒径、PDI、电位值

如图2-a所示，随着醇水比的增大，粒径无显著性变化，控制在125 nm，PDI控制在0.2～0.35间，呈现降低趋势但无显著变化；如图2-b所示，随着醇水比的提高，电位也无显著性变化，总体趋势为电位降低，控制在-32 mV左右。综合图2可知，体系中乙醇与水的比例对体系的影响不显著，可能是因为zein分子完全溶解于80%乙醇中，经过液-液自组装后由于zein独特的自组装性和AG的有效结合[13]，使得纳米颗粒均稳定分散在水体系中。该结果与YING提出zein制备得纳米颗粒对于乙醇的依赖性较低，且亲水胶体的结合有利于颗粒在水中的稳定性的结果一致[14]，因此从工业制备节约成本方面考虑，体系中应尽可能减少高成本乙醇的加入，选择醇水比为1∶50进行制备使纳米颗粒能够稳定存在。

图2 不同醇水比下zein-AG纳米颗粒粒径、PDI、电位对比图Fig.2 The effect of the different ratio of the ethanol∶water in the particle size, PDI, zeta-potential of the zein-AG nanoparticles

2.3 不同pH值下zein-AG纳米颗粒粒径、PDI、电位值

不同pH下纳米颗粒粒径、PDI如图3-a所示，粒径在120～140 nm无显著变化；PDI在pH=3时稍大于0.3，pH=4～9时均小于0.3呈稳定态，不同pH下纳米颗粒电位如图3-b所示，在pH=3时，电位相对较低为-17.8 mV，可能是因为pH=3时AG的荷电量较低，从而zein-AG纳米颗粒表面净电荷较少，因此体系电位不太稳定[15]；在pH=4～9内，电位都较为稳定且为-30～-40 mV。zein-AG纳米颗粒在pH=3～9条件下均能较好保持纳米颗粒状态并维持稳定，相比单纯zein纳米颗粒在等电点附近严重聚集的现象有显著改善。该结果与黄晓霞等研究果胶复合zein在pH=3较接近果胶的等电点时电位略低，pH=4～9时稳定性非常好的结果一致[16]。

图3 不同pH下zein-AG纳米颗粒粒径、PDI、电位图粒径、PDI；电位Fig.3 The effect of pH in the particle size, PDI, zeta-potential of the zein-AG nanoparticles

2.4 不同盐离子浓度下zein-AG纳米颗粒粒径、PDI、电位值

不同盐离子浓度下纳米颗粒粒径、PDI、电位如表1所示。盐离子浓度在0～20 mmol/L内，粒径、PDI随着盐离子浓度升高而显著增大至290.3 nm，电位逐渐增大至-20.2 mV，体系变得不稳定；盐离子浓度大于20 mmol/L时粒径为微米级，纳米颗粒严重絮凝，PDI为1；电位为-5 mV左右，即对盐离子耐受程度较弱，表明AG与zein通过静电相互作用结合而成[17]，作用力能够抵抗20 mmol/L的盐离子浓度。LUO等研究低离子强度下纳米颗粒就会发生絮凝的结果与该结果相同[18]。

表1 不同盐离子浓度下纳米颗粒粒径、PDI、电位表Table 1 The effect of PH in the the different concentrations of salt in the particlesize, PDI, zeta-potential of thenanoparticles

注：表中相同字母代表差异不显著(p<0.05);不同字母代表差异显著(p<0.05)。下同。

2.5 zein-AG纳米颗粒扫描电镜结果

图5所示是zein纳米颗粒和zein-AG纳米颗粒的扫描电镜的微观图，其中zein-AG纳米颗粒为最优条件(5%的zein储备液质量浓度、醇水比为1∶50)下制备所得。

a-zein 纳米颗粒；b-zein-AG纳米颗粒图5 纳米颗粒扫描电镜图(×20 000)Fig.5 The SEM of the nanoparticles

图5-a显示，未复合AG的zein纳米颗粒大小不均一，且有明显粘连，因为zein纳米颗粒的复溶性较差导致其颗粒间存在聚集状态；该结果与黄旭琳等[19]研究结果相同；图5-b显示zein-AG纳米颗粒呈现圆形，大小均一，且AG、zein没有分离状态，而是较好的复合在一起，该微观图与[11]等研究果胶复合zein纳米颗粒扫描电镜图反映出的结果相同，即AG能够通过静电相互作用结合zein形成稳定的纳米颗粒。

2.6 不同zein/AG与TOC质量比纳米颗粒负载生育酚粒径、PDI、电位值

不同zein/AG∶TOC比例纳米颗粒粒径、PDI如图6-a所示，随着纳米颗粒负载生育酚浓度的变大，粒径逐渐增高，小于1∶5时，负载生育酚的纳米颗粒粒径、PDI均较为稳定，此时TOC能够完全结合纳米颗粒；zein/AG与TOC质量比为1∶5时粒径为180.3 nm，PDI为0.29；大于1∶5时纳米颗粒粒径较大达到200 nm；PDI也大于0.3；图6-b所示随着zein/AG与TOC质量比减小，纳米颗粒电位也逐渐下降，大于1∶1.5时电位虽下降但无显著性，在-30 mV左右。该结果与WONGSASULAK等研究结果一致[20]。综上所述，zein/AG与TOC质量比1∶5时粒径、PDI、电位和包封率既稳定又高效，达到zein大分子高效负载生育酚的目的。

图6 不同zein/AG与TOC质量比纳米颗粒粒径、PDI、电位对比图Fig.6 The effect of zein/AG∶TOC in the particlesize, PDI, zeta- potential of the nanoparticles

2.5 zein-AG纳米颗粒负载生育酚包封率

由表2可知，随着zein-AG纳米颗粒负载生育酚含量的增大，体系包封率逐渐下降，在zein/AG与TOC质量比小于1∶5时，包封率逐渐增大至94.1%但无显著性，此时纳米颗粒体系中TOC的比例较小，能够完全被zein-AG结合，因而负载能力较强；在zein/AG与TOC质量比大于1∶5时，包封率显著降低，TOC比例过高导致负载能力较弱。zein/AG与TOC质量比为1∶5时，包封率仍达到86.9%。管骁等研究麦醇溶蛋白负载白藜芦醇时，负载率为90.4%能够支撑上述结果[21]；SUN等研究纳米颗粒负载姜黄素时，姜黄素含量越高包封率越低的结果一致[22]。

表2 不同zein/AG与TOC质量比下纳米颗粒对生育酚的包封率Table 2 The effect of zein/AG∶TOC of the encapsulationefficiency of TOC

3 结论

通过前期优化醇水比、zein储备液质量浓度等参数制备得到的复合AG的zein纳米颗粒能够耐酸碱，并一定程度上耐受盐离子，对于TOC的包封率较高达到90%左右，由此表明，AG可作为保护zein更好体内缓释输送药物的一种亲水性生物大分子进行使用， zein-AG复合纳米颗粒也可作为TOC的有效载体应用于其活性的保护与长效利用。