斜纹夜蛾SlSCP-2真核表达载体的构建及对胆固醇的吸收

张丽丽，万 星，王 娟，薛竞帆，武怡琼，靳 爽

(1．信阳师范学院 生命科学学院/大别山农业生物资源保护与利用研究院,河南 信阳464000；2.广州市昆虫发育调控与应用重点实验室,广东 广州 510631)

0 引言

斜纹夜蛾(Spodopteralitura)属鳞翅目(Lepidoptera)杂食性的农业害虫.蜕皮和变态主要由20-羟基蜕皮酮(20-Hydroxyecdysone，20E)和半萜类保幼激素 (Juvenile hormone, JH) 协调控制[1].

胆固醇是合成蜕皮激素的前体，同时也是构成细胞膜的重要成分.由于昆虫体内缺少从头合成胆固醇必须的两种酶：鲨烯合酶和羊毛甾醇合酶[2,3]，昆虫只能从宿主植物中吸收胆固醇来维持其生长和发育[3-5].疏水性胆固醇分子需要借助固醇转运蛋白(Sterol carrier protein)完成细胞内和细胞间的转运，进而合成细胞膜和蜕皮激素[6].

SCP蛋白家族至少包括4个成员：SCP-x、SCP-2、17-β-羟基固醇脱氢酶Ⅳ和UNC-24, 每个成员蛋白都有一个共同的C端SCP-2结构域[7].对斜纹夜蛾的SlSCP-x研究发现，SlSCP-x与脊椎动物SCP-x相似，通过翻译后部分剪切产生13 kDa的SlSCP-2[8].超表达SlSCP-x蛋白的细胞对胆固醇的吸收量增加；干扰SlSCP-x的mRNA转录，导致斜纹夜蛾幼虫血淋巴中的胆固醇水平明显下降，生长缓慢，蜕皮延迟[8].因此，固醇转运蛋白对昆虫的生长发育至关重要.本研究以对昆虫生长发育起重要作用的固醇转运蛋白作为靶点，构建高效表达斜纹夜蛾固醇转运蛋白的细胞株，为筛选抑制昆虫生长抑制剂的细胞筛选系统奠定基础.

本研究采用的是酵母FRT/Flp重组系统Flp-InTM将携带目的基因SlSCP-2的表达载体pcDNA5/FRT转染进入CHO细胞株中，表达出目的蛋白用于研究该蛋白对胆固醇的吸收,为竞争性抑制剂的筛选奠定基础.

1 材料和方法

1.1 材料

中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)、pcDNA5/FRT载体和pOG44载体，香港中文大学葛伟教授馈赠；大肠杆菌DH5α (E.coliDH5α)，本实验室保存的菌株；PCR常用试剂(dNTPs，10×buffer和rTaq)、DNA限制性内切酶、pMD18T载体、Solution Ⅰ、T4 DNA ligase、10×T4 DNA ligase buffer、Premixed protein marker(low)，TAKARA公司(大连，中国)；Western blotting杂交膜，英国Whatman公司；质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒，北京天根生物科技有限公司.细胞转染的LipofectamineTM2000，血清，F-12培养基粉末，Opti-MEM和hygromycin B，Invitrogen公司.扩增和检查基因表达所用的SlSCP-2上游引物5’-GGTACCATGGCCATGTACCGCAAAGGATTCGC-3’(划线处为Kpn I酶切位点)下游引物：5’-GCGGCCGCTTACAGTTTGGAGCGGATTGTGTCG-3’(划线处为Not I酶切位点).以GFP(Green fluorescence protein)序列的ORF设计上游引物：5’-GGTACCATGGTGAGCAAGGG-3’(划线处为Kpn I酶切位点)，下游引物：5’-GCGGCCGCTTACTTGTACAGCTCGCT-C-3’(划线处为Not I酶切位点),由上海英骏生物工程公司合成.分别以实验室构建的SlSCP-x质粒和EGFP-N1质粒为模板进行PCR扩增.

1.2 SlSCP-2 和GFP表达载体的构建及鉴定

运用限制性内切酶Kpn I和Not I对pMD-18T载体进行切割胶回收，分别将扩增出来的目的片段SlSCP-2和GFP连入切割之后的pMD-18T中，转化进入E.coliDH5α，经过氨苄青霉素筛选出单克隆，运用PCR和双酶切鉴定.再将目的片段分别插入经过酶切胶回收的表达载体pcDNA5/FRT中，转化进入E.coliDH5α，经过氨苄青霉素筛选出单克隆，运用PCR和双酶切初步鉴定，然后送到华大基因进行测序鉴定，最后运用瞬时转染，提取细胞总蛋白进行western blotting鉴定，最后命名为pcDNA5/FRT-SlSCP-2和pcDNA5/FRT-GFP.

1.3 细胞转染

将细胞接种于细胞培养板中，每孔加入2mL F-12完全培养基．在37 ℃含5% CO2的恒温培养箱中培养12 h，待细胞密度达到40%～60%，细胞状态良好时，准备转染.2 μg pcDNA5/FRT-SlSCP-2和pOG44载体(9∶1)，15 μL脂质体用Opti-MEM定容至100 μL，在培养箱中孵育30 min后加入细胞中，CO2培养箱中继续培养.24h后收集对照组和处理组细胞，在荧光显微镜下观察GFP的表达情况，并提取各组细胞的蛋白质进行western blotting鉴定.

1.4 SlSCP-2蛋白转染细胞后对胆固醇的吸收

为研究pcDNA5/FRT-SlSCP-2转染细胞对胆固醇的吸收，将转染后24 h的细胞对照组荧光显微镜下观察GFP的表达情况.实验组细胞一份收集细胞并提取蛋白质进行Western blotting鉴定SlSCP-2表达量；另外一组在细胞培养基中，分别加入0、5、10 μmol/L FITC-Cholesterol，8 h后收集细胞用流式细胞分析细胞中FITC-Cholesterol的吸收情况，重复3组.

1.5 潮霉素B筛选浓度确定

在转染前对CHO细胞进行剂量反应分析，以确定潮霉素B的最适浓度.细胞对潮霉素B敏感性的测定分别用0，50，100，250，500，750和1000 mg/L 7个不同浓度梯度的Hygromycin B处理相同数目但密度小于25%的CHO细胞，重复3组，每隔24 h观察记录细胞生长状况，直到120 h(约第5天)，收集细胞，用台盼蓝染色法统计3组细胞的死亡率，以杀死所有细胞的潮霉素B最低浓度(500 mg/L)为筛选浓度.

2 结果

2.1 pcDNA5/FRT-SlSCP-2和pcDNA5/FRT-GFP重组真核表达载体的构建与鉴定

将扩增的SlSCP-2连接进pMD18T构成pMD18T-SlSCP-2克隆质粒.将质粒pcDNA5/FRT和pMD18T-SlSCP-2克隆质粒分别用Kpn I和Not I双酶切并纯化后，经T4 DNA Ligase连接构成pcDNA5/FRT-SlSCP-2表达载体，由于载体pcDNA5/FRT表达的外源蛋白为非融合蛋白，没有任何检测标记，不利于后续实验的直接观察，故在载体pcDNA5/FRT的酶切位点Kpn I和Not I之间重新插入GFP序列的ORF，构成另一个新的表达载体pcDNA5/FRT-GFP，作为阳性对照，以便于检查整个构建过程.分别用构建好的表达载体pcDNA5/FRT-SlSCP-2和pcDNA5/FRT-GFP转化E.coliDH-5菌株，经氨苄青霉素的筛选，得到单克隆细胞.对单克隆细胞进行PCR检测(图1A)、双酶切检测(图1B)和测序比对(图1C),分析表明目的片段SlSCP-2(458 bp)和GFP(734 bp)的ORF已正确地插入到表达载体pcDNA5/FRT中.

2.2 斜纹夜蛾SlSCP-2真核表达载体的鉴定

为了检测构建的表达载体pcDNA5/FRT-SlSCP-2和pcDNA5/FRT-GFP能否正确表达目的蛋白，将构建的表达载体pcDNA5/FRT-SlSCP-2和pcDNA5/FRT-GFP分别转化进入Flp-InTM定点整合的中国仓鼠的卵巢细胞CHO中，转化24 h后，通过荧光倒置显微镜观察，GFP成功表达，见图2A，收集细胞总蛋白，用Anti-SlSCP-2抗体做western blotting检测，见图2B，与对照相比，转化的细胞成功表达出大小约13 kDa的SlSCP-2蛋白，小于16 kDa，可能是因为插入表达载体pcDNA5/FRT中的SlSCP-2序列在CHO细胞内翻译出16 kDa的 pro-SlSCP-2蛋白被蛋白酶切去N端约20个氨基酸肽段形成了SlSCP-2[9，10].此外，在western blotting检测结果中，发现被检测的细胞株均在15～25 kDa、35～40 kDa和100～130 kDa之间检测出未知蛋白的表达，可能由于用于实验的抗体为多克隆抗体，能够与CHO细胞中存在的某些未知蛋白结合.

图1 PCR (A)、双酶切 (B)和目的片段测序 (C)检测SlSCP-2(458 bp)和GFP(734 bp)的ORF在表达载体pcDNA5/FRT上插入情况Fig. 1 Detection of the ORF of SlSCP-2(458 bp)andGFP(734 bp)inserted into pcDNA5/FRT expression vectorby PCR (A), double digestion (B) and sequencing (C)

2.3 真核细胞中SlSCP-2蛋白表达对胆固醇吸收的影响

为了进一步检测转染SlSCP-2蛋白的细胞株对胆固醇吸收的影响，首先通过western blotting检测经pcDNA5/FRT-SlSCP-2表达质粒转染后24 h的CHO细胞是否表达了SlSCP-2目的蛋白, 结果表明，用Anti-SlSCP-2蛋白抗体能检测到转染后CHO细胞中SlSCP-2的蛋白表达(图3A).

细胞先培养在无胆固醇的培养基中，然后再转移到含不同浓度胆固醇的培养基中培养8 h，然后用流式细胞仪分析转染后细胞内FITC-胆固醇含量的变化.流式细胞分析结果表明，经pcDNA5/FRT-SlSCP-2质粒转染的Spli221细胞中胆固醇含量随着胆固醇浓度的增加而提高(图 3B).以上结果说明, SlSCP-2蛋白促进了细胞从培养基中对胆固醇的吸收.

图2 SlSCP-2和GFP在CHO中瞬时表达(A)和western blotting分析(B)

注：A. 荧光倒置显微镜观察GFP蛋白表达; B. western blotting检测SlSCP-2蛋白表达; CK: 原核诱导表达重组蛋白SlSCP-2; CHO: 未做转染的CHO细胞总蛋白; pcDNA5/FRT：转染质粒pcDNA5/FRT的CHO细胞总蛋白；pcDNA5/FRT-GFP: 质粒pcDNA5/FRT-GFP转染的CHO细胞总蛋白; pcDNA5/FRT-SlSCP-2：质粒pcDNA5/FRT-SlSCP-2转染的CHO细胞总蛋白.

图3 SlSCP-2蛋白在CHO细胞中在细胞中的表达(A)对胆固醇吸收(B)的影响Fig. 3 The effect of the expression of SlSCP-2 protein in CHO cells (A) on the absorption of cholesterol (B)

注：A. western blotting检测SlSCP-2蛋白在CHO细胞中的表达; B. 流式细胞仪检测SlSCP-2蛋白在含胆固醇培养基中8 h后细胞内胆固醇含量的变化.

2.4 细胞对潮霉素B敏感性的测定

为了筛选出目的基因稳定转化的细胞株，采用潮霉素B淘汰未发生转化的不具有潮霉素B抗性的细胞株.当潮霉素B进入无抗性的细胞中，在细胞中巯基化合物的作用下获得电子而被激活，通过诱导 mRNA 模板的误读而抑制蛋白质合成，导致无抗性细胞的死亡，而那些转化的细胞株因具有潮霉素B抗性而得以存活[9].潮霉素B的浓度过高也会把阳性单克隆细胞杀死，不利于筛选；潮霉素B的浓度过低则大量非阳性单克隆细胞存活，假阳性增多，筛选效率降低[9].因此，确定最适的潮霉素B的浓度对于稳定细胞株的筛选工作至关重要.

为了确定用于筛选的最适潮霉素B的浓度，分别用0、50、100、250、500、750和1000 mg/L等7个不同浓度梯度的潮霉素B处理相同数目但密度小于25%的CHO细胞，重复3组，每隔12 h观察记录细胞生长状况，直到120 h(约第5天)，收集细胞，并用台盼蓝染色法(Flp-InTMsystem from invitrogen)统计3组细胞的死亡率.由观察结果可知，随着潮霉素B浓度的增高和作用时间的延长，细胞死亡率提高.最适作用浓度应为在1～2周内能够杀死全部非转化细胞的最低药物浓度.结果表明，在相同的作用时间里，500 mg/L的潮霉素B能将非转化细胞杀死，见表1.

表1 台盼蓝染色法测定不同浓度的潮霉素B处理下CHO细胞的死亡率 (%)

这些结果为进一步筛选稳定转化的pcDNA5/FRT-SlSCP-2细胞株提供了实验基础.

3 讨论

固醇转运蛋白是生物体内广泛存在的蛋白，主要参与固醇类和脂类的吸收和转运.在脊椎动物中，主要在蛋白的结构、细胞定位、表达模式、调控模式、功能及应用等方面进行了深入研究.而在昆虫中该蛋白的研究相对较少，目前已经在果蝇、埃及伊蚊、冈比亚按蚊、棉铃虫、棉贪夜蛾、斜纹夜蛾和家蚕中发现了固醇转运蛋白基因[8,12，13].研究主要集中在该蛋白的结构、功能、表达模式、调控模式、组织和亚细胞定位，但是对于该蛋白的应用方面研究较少.应用埃及伊蚊的固醇转运蛋白AeSCP-2作为靶点，已筛选出AeSCP-2的抑制剂AeSCPI, 能够抑制AeSCP-2与胆固醇的结合，阻断蜕皮激素的生物合成，从而有效地杀死埃及伊蚊[14].后续的研究还发现该抑制剂对鳞翅目的棉铃虫也具有良好的杀虫效果[15].

斜纹夜蛾Spli221细胞中超表达该蛋白能够增加细胞对胆固醇的吸收；而抑制该蛋白的表达，则血淋巴中胆固醇的含量下降，虫体蜕皮延迟，生长缓慢[8].利用该蛋白优化的三维结构通过虚拟筛选、体外结合实验和生物鉴定实验发现了4种抑制剂与蛋白有高的亲和力[6].这些结果说明，SlSCP-2对斜纹夜蛾的正常生长和发育是非常重要的，应用此蛋白进行昆虫生长抑制剂的筛选是可行的.但是原核表达体系存在表达蛋白修饰和高级折叠结构不完整的特点，可能影响该蛋白的功能[16-17].细胞具有能够持续稳定表达结构完整目的蛋白的优点，目前在果蝇属、蚊和家蚕等昆虫中建立稳定转化细胞株用于蛋白功能的研究和化合物的高通量筛选[18-20].在家蚕中，已经构建了家蚕30Kc6蛋白稳定转化的CHO细胞株，运用此转化细胞株可以显著提高重组人促红细胞生成素(recombinant human erythropoietin，EPO)在该细胞株中的表达，表达量增加达5到10倍[21].并且运用此转化的细胞株研究还发现家蚕30Kc6蛋白抑制细胞凋亡的机制[20].在化合物高通量筛选方面的研究，已经成功构建了铜绿蝇Luciliacuprina乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase)稳定转化的人胚肾细胞株(Human Embryonic Kidney 293 cells，HEK293)，并应用该蛋白作为药物靶点，通过高通量筛选鉴定新的乙酰胆碱酯酶抑制剂[18].

4 结论

本研究在细胞水平瞬时高效表达SlSCP-2蛋白，显著提高了细胞中胆固醇的吸收，利用SlSCP-2为靶标蛋白进行昆虫生长抑制剂的筛选是可行的.潮霉素筛选浓度的确定为进一步获得稳定转化的细胞株提供了实验参考.这些都为建立斜纹夜蛾固醇转运蛋白稳定转化细胞株用于化合物的筛选和蛋白的功能研究奠定基础.