青海省不同生态区蚕豆根瘤菌16S rDNA分析

张小娟

(青海大学生态环境工程学院,省部共建三江源生态与农牧业国家重点实验室，青海 西宁 810016)

蚕豆不仅是一种重要的粮食作物，同时也是蔬菜、饲料和绿肥。蚕豆作为粮食作物，可为人体提供所必须的蛋白质和其它各类营养物质；蚕豆的根瘤较其它作物大而且多，因此蚕豆享有“生物固氮之王”的美誉[1-2]。蚕豆与禾本科其它作物套种可带来良好的经济效益，是“绿色农业”中重要的养地作物。根瘤菌与豆科植物的共生固氮体系是生物固氮中效率最高的体系，约占生物固氮总量的65%。该体系具有固氮能力强、固氮量大、抗逆能力强等特点，可以提高土壤肥力，对可持续农业的发展具有重要的意义[3-7]。蚕豆根瘤菌共生体系是这一体系的成员之一，对其进行广泛和深入的研究，可以加强对共生固氮的认识。目前国际上对蚕豆根瘤菌有不少的研究，但是对同一品种不同区域共生的根瘤菌研究较少[8-10]。本研究采用16S rDNA全序列分析的方法对青蚕14号蚕豆品种在不同生态区的根瘤菌进行系统发育研究。鉴定筛选共生紧密的根瘤菌为蚕豆根瘤菌的配型及根瘤菌菌剂生产提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 6-7月在青蚕14号生长地区进行采样，本研究选择青海省湟中县拦隆口镇及海子沟乡、共和县铁盖乡、乐都县蒲台乡、互助县台子乡和西宁市为青蚕14号根瘤菌采样地，这6个地区为青蚕14号主要栽培区，地理特征上属于半干旱地区，光照充沛，气候干燥。除互助县台子乡和乐都县蒲台乡为水浇地外，其余5个地区均为旱地。采集植株高大，根系发达，根瘤较多且根瘤颜色鲜艳、形状饱满，体积较大的蚕豆样本。将蚕豆的根部装入样本袋中(不要去掉泥土)，标注好日期地点。-20℃冰箱内保存备用。采样地区、经纬度及采集的根瘤菌形状见表1。

表1 供试菌株Table 1 The tested strains

1.1.2 引物 PCR引物选用根瘤菌16S rDNA通用引物。扩增引物序列：P1：5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AGA ACG AAC GCT-3’;P2：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC’-3。

1.2 方法

1.2.1 蚕豆根瘤菌的分离和纯化 将冰箱中的备用蚕豆样本取出，用镊子将根上的根瘤小心剥下，用自来水冲掉泥土，用蒸馏水洗净并装入离心管。向离心管中加水至没过根瘤，浸泡1 h以上，使根瘤充分吸水膨胀。在超净工作台中，用95%乙醇浸泡1 min，随即75%乙醇浸泡30 s，无菌水冲洗一次，5%次氯酸钠浸泡5 min，无菌水冲洗10次。将表面消毒的根瘤在研钵中碾碎，并加入适量无菌水，搅拌均匀。平板涂布法接入YMA培养基中。28℃培养2～3 d。纯化方法采用平板连续划线法。将长出的根瘤菌用接种环挑出，在YMA平板上连续划线，培养3～5 d长出单菌落。

1.2.2 蚕豆根瘤菌基因组DNA的提取 基因组DNA的提取采用BioSpin细菌基因组DNA提取试剂盒。基因组DNA检测：取 2.5 μl PCR 扩增产物与 2.5 μl溴酚兰混合点样，0.8%琼脂糖凝胶水平电泳，在120 V条件下电泳30 min。凝胶电泳成像系统下拍照观察。

1.2.3 蚕豆根瘤菌16S rDNA的PCR扩增 PCR扩增在Model MG96+基因扩增仪上进行扩增。反应体系(10 μl)：Mix 7 μl，模板DNA 1 μl，上下游引物各1 μl，ddH2O补足。反应程序为：94℃预变性 5 min，94℃变性30 s，50℃复性45 s，72℃延伸1.5 min， 36 个循环，最后72℃延伸10 min，4℃保存。扩增结束后,在反应混合物中加入5 μl溴酚蓝,混匀。取7 μl点入含0.5 μg·ml-1溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶中,于1×TAE电泳缓冲液中、100 V电场下电泳90 min, 凝胶电泳成像系统下拍照观察。PCR扩增产物回收：回收采用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工生物技术有限公司生产)。

1.2.4 根瘤菌16S rDNA全序列测定 用于测序的菌株PCR扩增产物回收后直接测序，由上海生工生物技术有限公司完成测序。从GenBank中获取参比菌株的16S rDNA 序列，数据经编辑后应用MEGA 6进行比对，并利用Neighbor-Joining法构建供试菌株与参比菌株的系统发育树。

2 结果与分析

2.1 蚕豆根瘤菌的筛选及基因组DNA电泳结果及16 S rDNA的扩增

首先对采取的根瘤菌样本进行筛选，从中获得了6个菌株，即CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6。对这6株根瘤菌提取基因组DNA并进行检测(图1)，结果显示其DNA大小均在20 kb左右，电泳条带整齐完整，无杂质和RNA污染，可满足后续实验的要求。利用根瘤菌16S rDNA通用引物对筛选的6个菌株进行PCR扩增(图2)。

2.2 供试菌株与各参比菌株之间16 S rDNA基因全序列的相似性

获得的测序结果，利用DNAstar进行编辑，在 GenBank database (http://www.ncbi.nlm.nib.gov/)比对，从中获得参比菌株序列，应用MEGA6进行比对，并利用 Neighbor-Joining法构建供试菌株与参比菌株的系统发育树。

1. CD1; 2. CD2; 3. CD3; 4. CD4; 5. CD5; 6. CD6图1 根瘤菌基因组DNA电泳图谱Fig.1 Electrophoresis of rhizobium genomic DNA

1. CD1; 2. CD2; 3. CD3; 4. CD4; 5. CD5; 6. CD6图2 根瘤菌16S rDNA PCR扩增图谱Fig.2 16S rDNA PCR products of rhizobiums

将6个供试菌株进行扩增回收后测序，将序列与NCBI中已报道的序列进行相似性比对，比对结果如表2。供试6个蚕豆根瘤菌菌株分属5个不同系统发育分支。其中供试菌株CD4与KF008225.1相似度最高，达到98%，其余均在95%～96%之间。说明同一品种不同区域共生菌株不相同。

2.3 系统发育树构建

利用MEGA 6.0对供试菌种进行Clustal比对之后(图3)，与参比菌种进行聚类分析构建参比菌株与供试菌株的N-J树，从图4可以看出CD1和CD2共属同一菌属，即节细菌属(Arthrobacter)，CD3属于分枝杆菌属(Mycobacterium)，CD4和CD5属于快生根瘤菌属(Rhizobium)，CD6属于中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)。来自不同地区的根瘤菌显示出很大差异，说明青海省不同生态区根瘤菌种类比较丰富。具体的分类地位还需要进一步研究。

3 讨 论

本研究通过同一品种不同生态区6个菌株16S rDNA全序列数据分析和系统发育树显示位于5个系统发育分支上。CD1、 CD2同属一个类群节细菌属(Arthrobacter)，CD4、CD5同属一个类群快生根瘤菌属(Rhizobium)，CD3，CD6分别属于分枝杆菌属(Mycobacterium)和中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)。4个类群亲缘关系较近。

表2 供试菌株与各参比菌株之间16S rDNA全序列的相似性分析Table 2 Similarity between strains in 16S rDNA sequence

图3 供试菌种序列比对Figure 3 Clustal alignment between tested strains and the reported cultures

图4 供试菌种与参比菌种系统发育进化树Fig.4 Phylogentic tree based on aignment of the known cultures and tested strains

同一寄主在不同环境条件下共生了不同的菌种，说明青海不同区域有着不同的根瘤菌，其遗传多样性比较丰富。目前16S rDNA全序列分析是较为普遍及准确的确定根瘤菌系统发育研究的方法，一般来说，菌种相似度在95% 以上可以认为是同一个种，但是在本研究进行过程中发现相似度最高的菌种有时并不是根瘤菌属，而其他文献对此现象也有报道[4]。因此在确定其分类地位时还要结合DNA同源性分析来决定[9]。

对于青海省蚕豆根瘤菌的研究目前还比较少，本研究分离出来的根瘤菌品种与之前报道过的存在较大差异，对于青海省蚕豆根瘤菌确切的种类及系统发育研究还需进一步扩大样品数量，收集更多代表性菌株，扩大多样性。

环境条件对根瘤菌有着深刻影响，包括对根瘤菌的直接影响和通过影响宿主植物间接地影响根瘤菌的遗传多样性区域环境条件的改变，既影响着宿主植物的生长，也改变了根瘤菌的生长条件，造成根瘤菌种群变化和数量的增减，因而在同一环境中出现了根瘤菌表型和遗传型的多样性。

在本研究中，从各地区分离的蚕豆根瘤菌无论是表型分析还是遗传型分析都没有按照地理来源进行聚群、根瘤菌与豆科植物共生关系的建立是细菌、植物及环境三方相互作用的结果，只有适应当地的土壤条件且又有高效固氮及竞争能力的豆科植物根瘤菌共生体才能在该地发挥应有的作用。