超高效液相色谱-串联质谱方法测定桑葚中吡虫啉和啶虫脒残留量

李国烈，杜 鑫，苏 旭，覃明丽，蒋金芳

(南充农产品质量监测检验中心，四川 南充 637000)

吡虫啉和啶虫脒是新一代烟碱类农药，具有杀虫谱广、持效期长、内吸性强、不易挥发、高效、低毒等特点[1-2]。吡虫啉能有效防治鞘翅目、同翅目、鳞翅目和双翅目类害虫，同时可杀灭对有机磷农药等传统杀虫剂有抗药性的害虫[3-4]。啶虫脒是吡虫啉的一种开环衍生物，除具有吡虫啉良好的杀虫活性外，还有优良的杀卵活性，而且与常规农药无交互抗性[5]。由于这两种杀虫剂的显著优势，近年来被广泛用于果桑生产中，主要用于防治桑木虱、白粉虱、蚜虫、桑毛虫、桑椹瘿蚊、桑尺蠖、桑天牛、桑蓟马和红蜘蛛等病虫害[6-11]。但在实际生产中，由于用药不当会造成桑葚中化学农药残留污染，危害人类健康和产业发展[12]。到目前为止，尚未见关于吡虫啉和啶虫脒在桑葚中的残留检测报道。本试验建立了桑葚中吡虫啉和啶虫脒残留检测的超高效液相色谱-串联质谱方法(UPLC-MS/MS)，以期为桑葚中吡虫啉和啶虫脒的残留检测提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验药品和试剂 吡虫啉和啶虫脒(Krexiom-methyl)标准品购于农业部环境保护科研监测所(编号分别为GSB-1890-2008和SB-108-2008)，甲醇、乙腈，甲苯，甲酸均为色谱级，购自Fisher公司。

1.2 仪器和设备 超高效液相色谱-质谱仪(Waters，UPLC-TQS)，色谱柱(Waters，Xbridge C18，3.5μm 3.0×50mm)，超纯水仪(Millipore，Milli-Q)，旋涡混合器(IKA，Vortex Genius 3)，摇床(IKA，HS501)，离心机(Sigma，3-18KS)，氮吹仪(Organomation，N-EVAP112)，固相萃取小柱(Agilent，Mega BE CARB/NH2500mg/6mL)，固相萃取装置(Agilent)，50mL离心管(Eppendorf)以及微孔滤膜(津腾，PTFE 0.22μm)等。

1.3 样品前处理 准确称取匀浆后的桑葚样品10.00g于50mL离心管中，加入20.00 mL乙腈，置于摇床上振摇30min，加入5g氯化钠，盖上塞子，剧烈震荡1min，置于离心机中10 000r/min离心10min，移取上清液10.00 mL待净化。

1.4 样品净化 将移取的10.00 mL提取液加入已经过5 mL乙腈+甲苯(3∶1，V/V)预淋洗Mega BE CARB/NH2柱，收集淋洗液，再用25mL乙腈+甲苯(3∶1，V/V)分5次洗脱，合并淋洗液，于40℃氮吹吹至近干，用5.00mL 50%甲醇定容，旋涡混合器混匀后过0.22μm滤膜，待检测。

1.5 超高效液相色谱-质谱条件 流动相采用甲醇，乙腈和含有0.1%甲酸水溶液进行梯度洗脱，洗脱程序(表1)，流动相使用前用超声波脱气。色谱柱温：35℃，样品室温度16℃，进样量：2μL。质谱采用电喷雾离子源正离子模式(ESI+)，多反应监测(MRM)方式进行采集，相关参数(表2)。

表1 流动相及梯度洗脱条件

续表

表2 测定吡虫啉和啶虫脒在桑葚中残留的质谱参数

1.6 标准曲线和检测限 分别取一定量的吡虫啉和啶虫脒标品溶液用桑葚空白基质配制成浓度为0.10、1.00、5.00、10.00、20.00、50.00和100.00μg/L的基质标准溶液，采用1.5仪器条件进行分析，以吡虫啉和啶虫脒定量离子的峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标作标准曲线，并进行回归分析求出回归方程和相关系数。标准曲线采用Masslynx V4.1软件绘制。检测限采用在最低浓度附近添加一系列已知浓度的双份样品进行测定，采用Masslynx V4.1软件计算吡虫啉和啶虫脒的信噪比(S/N)，以S/N≥3时的样品浓度为方法检测限[13]。

1.7 回收率 回收率试验采用加标回收试验法。

回收率(%)=样品实测浓度/样品理论浓度×100%。

取桑葚空白样品，根据高、中、低3个浓度分别加入相应的吡虫啉和啶虫脒标准溶液，每个浓度水平做6个平行质控样品。所有样品按1.3和1.4进行样品前处理，采用1.5仪器条件测定药物浓度，根据随行测定的基质标准曲线计算样品的实测浓度与样品理论浓度的百分比。

1.8 精密度 精密度试验采用加入法。取桑葚空白样品，根据高、中、低3个浓度分别加入相应的吡虫啉和啶虫脒标准溶液，每个浓度水平做6个平行。所有样品按1.3和1.4进行样品前处理，采用1.5仪器条件测定药物浓度，连续测定3d，根据随行测定的基质标准曲线计算样品的实测浓度，即可求得方法的日内和日间精密度。

2 结果与分析

2.1 方法选择性 该试验条件下，吡虫啉和啶虫脒采用反相液相色谱分离，流动相中加入0.1%体积分数的甲酸来提高ESI+的离子化效率。结果表明，吡虫啉和啶虫脒保留时间分别为3.69min和3.92min，峰形及分离度良好，且可获得较强的分子离子峰强度，桑葚基质对桑葚样品中吡虫啉和啶虫脒的测定无干扰。吡虫啉基质标准溶液图谱，桑葚空白样品图谱和桑葚加标样品图谱(图1、图2和图3)，啶虫脒基质标准溶液图谱，桑葚空白样品图谱和桑葚加标样品图谱(图4、图5和图6)。

图1 吡虫啉基质标准溶液图谱(1.00μg/L)

图2 桑葚空白样品图谱

图3 桑葚加标样品图谱(1.00μg/kg)

图4 啶虫脒基质标准溶液图谱(1.00μg/L)

图5 桑葚空白样品图谱

图6 桑葚加标样品图谱(1.00μg/kg)

2.2 标准曲线和检测限 吡虫啉和啶虫脒基质匹配标准曲线在质量浓度0.10～100.00μg/L时线性关系良好，标准曲线回归方程分别为y=1.361 4×104x+6 547(R2=0.999)和y=7.074 2×104x+68 113(R2=0.997)。以3倍基线噪音的药物浓度为最低检测限，吡虫啉和啶虫脒在桑葚中的方法检出限(method detection limit，MDL)均为0.02μg/kg。以4倍MDL为测定下限[11]，即4倍方法检出限浓度作为测定下限，则吡虫啉和啶虫脒在桑葚中的测定下限为0.10μg/kg。

2.3 回收率 吡虫啉和啶虫脒在1.00、10.00和100.00μg/kg 3个浓度下的桑葚添加样品回收率分别为106.45%、94.46%、92.54%和90.47%、94.93%、86.88%，相对标准偏差均在5.00%以内，(表3)，表明该试验方法在测定桑葚中吡虫啉和啶虫脒的残留时具有较好的回收率。

表3 桑葚中吡虫啉和啶虫脒回收率(n=6)

2.4 日内精密度和日间精密度 该试验条件下，吡虫啉和啶虫脒在1.00、10.00和100.00μg/kg 3个浓度的桑葚添加样品日内精密度相对标准偏差分别为2.68%、3.66%、2.77%和2.52%、3.09%、3.27%，日间精密度相对标准偏差分别为3.47%、4.65%、4.01%和3.55%、4.56%、3.98%，(表4)。结果表明，该试验方法在检测桑葚中的吡虫啉和啶虫脒时，具有很好的重现性和稳定性。

表4 桑葚中吡虫啉和啶虫脒日内精密度和日间精密度(n=6)

3 讨论

该试验样品采用乙腈提取，石墨化碳黑氨基复合柱净化，超高效液相色谱-质谱法(UPLC-MS/MS)检测吡虫啉和啶虫脒在桑葚中的残留，该方法前处理过程操作简便，方法的选择性、标准曲线、检测限、回收率和精密度均满足样品分析方法要求。该试验采用空白基质匹配标准校正法来降低和消除基质效应对检测结果的影响。