生物功能化碳量子点制备

杨 佩 许 斌 孙清江

(东南大学生物科学与医学工程学院, 南京210096)(东南大学生物电子学国家重点实验室, 南京210096)

碳量子点或碳点是一种新型零维碳纳米材料，其尺寸小于10 nm．Xu等[1]在分离与提纯单层碳纳米管时首次发现了碳量子点．碳量子点具有优良的光化学性能、良好的生物相容性、低毒性和易于表面修饰等优点，因此在生物成像、生物传感器以及纳米载体等方面有着广泛的应用[2-4]．通常碳量子点表面拥有不同的功能团，例如，羧基、羟基以及氨基等[5]，表面基团单一性有利于碳量子点进行化学修饰和生物偶联，通过不同的方法可以实现碳量子点表面基团的单一化，如：通过聚乙烯亚胺(PEI)可合成富含氨基的碳量子点[6]，利用氯乙酸钠(ClCH2COONa)可制备得到富含羧基的碳量子点[7]．这些基团不但使碳量子点具有很好的水溶性，同时也有利于具有生物功能的分子对碳量子点的功能化[8]．

近年来，作为新一代的诊疗技术，“精准医疗”由于其准确性和快捷性的特点在生物医学领域得到了广泛关注[9]．碳量子点经生物功能化后，不仅拥有碳点本身的优异的荧光、物理和化学性质，还能具有特定生物功能，如癌细胞靶向和细胞核靶向等能力．这些功能可极大地扩展碳点在生物医学领域中的应用，实现细胞内靶向药物运输以及特定位置的荧光成像分析．碳量子点尺寸一般在10 nm以下，非常易于进入细胞内，但对细胞内的细胞器靶向定位甚至进入到细胞核中仍然是个极具挑战性的任务[10]．

PEG是一种呈中性的水溶性聚合物分子，具有良好的生物相容性，被广泛地用作修饰或掺杂分子以提高生物材料的生物相容性[11-12]．修饰PEG的方法大致可分为2类：一步合成和二步修饰．一步合成方法主要将PEG作为碳量子点合成的碳源或钝化剂，使得碳量子点在合成后含有PEG，拥有良好的生物相容性[13]；二步修饰方法是在合成碳量子点后，再将PEG作为可修饰的功能分子，通过共价键偶联至碳量子点表面，PEG能很好地保持其分子的完整性，对碳量子点的物理、化学和荧光等方面的稳定性有着很大的提升，提高了碳量子点的抗环境干扰能力[14]．TAT被用作经典的核定位信号序列，可用于实现碳量子点作为纳米载体对细胞核靶向的功能[15]．FA是一种典型的细胞靶向分子，能与细胞膜上的叶酸受体相结合，促进其进入细胞，而癌细胞表面拥有过度表达的叶酸受体，可以通过FA实现被癌细胞摄取的能力[16]．

本文用预先羧基化处理的碳量子点(CD)修饰生物分子PEG，TAT和FA，制备了生物功能化的碳量子点．第1步利用羧基与氨基的EDC/NHS反应一步在羧基化的碳量子点表面偶联上PEG和TAT，制备了具有良好生物相容性和细胞核靶向的水溶性碳量子点(TAT-CD-PEG)．第2步通过TAT-CD-PEG上PEG部分的羟基与FA的羧基之间的酯化反应，将FA修饰至TAT-CD-PEG的表面，为碳量子点提供癌细胞受体介导内吞的功能，最终制备得到PEG，TAT和FA修饰的具有生物功能的碳量子点．

1 材料与方法

1.1 实验试剂及仪器

主要试剂包括：合成碳量子点的原材料柠檬酸(CA)和乙二胺(EDA)，氢氧化钠(NaOH)，氯乙酸钠(ClCH2COONa)，聚乙二醇(PEG)，叶酸(FA)，核定位肽(TAT)，EDC，NHS，PB缓冲液(pH=8.0)．实验所有试剂均为分析纯，所用水均为超纯水，电阻率为18.2 MΩ·cm．

主要仪器包括：F-7000型荧光分光光度计(日本Hitachi公司)；JEM-2100型透射电子显微镜(日本JEOL公司)； ZS90型电位粒度分析仪(美国Malvern公司)；红外光谱仪(美国Thermo 公司)；TSC-SP8型共聚焦显微镜(德国Leica公司)；冷冻干燥机(中国北京医康实验仪器有限公司)；CT18RT型离心机(美国Techcomp公司)；KQ-500DB型超声波振荡仪(中国昆山市超声仪器有限公司)；紫外可见分光光度计(日本Hitachi公司)．

1.2 碳量子点的制备

碳量子点合成根据文献报道的方法[17]，以柠檬酸为碳源，乙二胺为表面钝化剂，通过水热法合成，具体方法为：合成所用柠檬酸与乙二胺以摩尔比为1∶4溶于50 mL水中，再将溶液转移至聚四氟乙烯内衬的反应釜中，在180 ℃条件下加热5 h；待冷却至室温后，将得到的碳量子点原液用分子截留量为1 kDa的透析袋透析2 d，除去未反应完全的反应物；最后将透析后的碳量子点溶液用冷冻干燥机进行浓缩，得到纯化后的碳量子点溶液．

1.3 碳量子点羧基化

将1 mg/mL的碳量子点溶液与含有125 mg NaOH和125 mg ClCH2COONa的水溶液混合，水浴超声3 h；再将此碳量子点溶液用稀HCl调节pH值至中性后，用分子截留量为1 kDa的透析袋透析1 d，经冷冻干燥浓缩后得到羧基化的碳量子点溶液．

1.4 荧光量子产率计算

碳量子点的荧光量子产率通过以下公式计算得到：

式中，Q,QR分别为待计算物质和参照荧光物质的荧光量子产率；I,IR分别为待计算物质和参照荧光物质的发射光谱荧光强度；A,AR分别为待计算物质和参照荧光物质的吸收强度;n,nR分别为待计算物质和参照荧光物质的折射率．本文选取的参照荧光物质为硫酸奎宁，当以360 nm为激发波长时，硫酸奎宁在0.1 mol/L的硫酸溶液中的荧光量子产率为0.54．碳量子点与硫酸奎宁的溶剂折射率均为1.33，为最小化吸收带来的影响，取碳量子点吸收值强度小于0.1，以此计算得碳量子点的荧光量子产率．

1.5 TAT-CD-PEG制备

将1 mg/mL羧基化后的碳量子点溶液与含有15 mg EDC和10 mg NHS的水溶液混合，水浴超声1 h，对碳量子点表面的羧基进行活化；往活化后的碳量子点溶液中同时加入20 mg/mL的PEG溶液和4 mg/mL的TAT溶液，搅拌24 h，用分子截留量为2 kDa的透析袋透析1 d，经冷冻干燥浓缩后得到PEG和TAT修饰的碳量子点(TAT-CD-PEG)．

1.6 FA偶联TAT-CD-PEG

通过FA一端的羧基与TAT-CD-PEG表面的羟基之间的酯化反应，将FA修饰至TAT-CD-PEG表面．具体实验过程如下:将FA溶于pH为8.0的PB缓冲液中，得到浓度为1 mg/mL的FA溶液，与含有10 mg EDC和15 mg NHS的PB缓冲液混合，活化FA上的羧基1 h；随后往活化后的FA溶液中加入4 mg/mL的TAT-CD-PEG溶液，室温避光环境下搅拌24 h，用分子截留量为1 kDa的透析袋透析1 d，经冷冻干燥浓缩后得到TAT-CD-PEG-FA．

1.7 细胞成像

HeLa细胞拥有较大的细胞核，将其选作成像用细胞．分别完成了TAT-CD-PEG和TAT-CD-PEG-FA与HeLa细胞培养2组实验．在HeLa细胞培养液中分别加入0.1 mg/mL的TAT-CD-PEG和TAT-CD-PEG-FA溶液与HeLa细胞共培养，分别培养2, 4, 6, 12 h后，用PB缓冲液冲洗，并用多聚甲醛将细胞固定，用核酸染料Syto 9对HeLa细胞核进行染色，通过共聚焦显微镜观察成像结果．用405 nm激发波长激发TAT-CD-PEG-FA荧光，收集440～460 nm范围内发射的荧光，488 nm激发波长激发Syto 9，收集490～510 nm范围内发射的荧光．

2 实验结果与讨论

2.1 CD的性质

图1对CD的性质进行了表征．由CD的荧光光谱(见图1(a))可看出，该CD没有激发波长依赖性，在以320～380 nm波长激发时，CD的发射波长在450 nm处，属于蓝光波长范围，在紫外灯照射下CD呈明亮的蓝色荧光(见图1(b))．该CD具有良好的荧光性质．对CD的吸收(见图1(c))进行了测定，CD在350 nm处有非常明显的吸收峰，并且通过CD在360 nm处的吸收值，由荧光量子产率公式计算出CD的荧光量子产率为 25%．进一步对CD进行了TEM表征(见图1(d))，从TEM照片可以看出CD具有很好的单分散性，经粒径统计(见图1(e))，CD的尺寸为(1.4±0.5) nm．通过荧光特性和粒径分析可以得知CD具有良好的光学性质，并且具有较小且均一的尺寸分布和良好的单分散性，可用于进一步的生物功能化．

(a) 荧光光谱

(b) 荧光照片

(c) 吸收光谱

(d) TEM

(e) 粒径统计

图1 CD性质表征

2.2 TAT-CD-PEG-FA的荧光和红外表征

图2 TAT-CD-PEG-FA制备示意图

(a) 荧光光谱

(b) 红外光谱

2.3 TAT-CD-PEG-FA的物理化学性质

制备完成TAT-CD-PEG-FA后，使用电位粒度分析仪对其Zeta电位与DLS进行了测量．从Zeta电位图谱(见图4(a))中可看出，CD生物功能化前后的Zeta电位发生了变化，由最初CD的-24.3 mV到TAT-CD-PEG的-3.2 mV，再到TAT-CD-PEG-FA的2.4 mV，表明CD在进行两步生物功能化之后Zeta电位呈中性．水动力尺寸(见图4(b))从最初的4.1 nm 到最后的6.1 nm，表明在生物功能化后CD的水合动力尺寸有略微增加，仍保持了较小的水合动力尺寸．为了确保TAT-CD-PEG-FA能应用于细胞内，对其进行细胞毒性实验，MTT实验(见图4(c))表明在不同浓度TAT-CD-PEG-FA条件下，细胞存活率在95 %以上，表明该TAT-CD-PEG-FA具有低毒性．纳米材料在细胞内进行应用需要满足以下特点：① 低毒性，保证材料在进入细胞后，不会对细胞生存和正常的代谢活动产生较大的影响或杀死细胞；② 生物相容性好，良好的生物相容性能使纳米材料更容易进入细胞；③ 小尺寸，尺寸越大进入细胞的难度越大，甚至有可能引起细胞的免疫应答，小尺寸的纳米材料更容易被细胞吞噬进细胞内；④ 呈电中性，细胞内有各种带电的蛋白，呈正电或负电的纳米材料进入细胞容易通过经典作用被细胞的蛋白吸附，造成非特异性吸附，不利于纳米材料在细胞内实现相应的功能．本文中合成的CD本身具有小尺寸和低毒性的特点，经过PEG和FA生物功能化修饰后不仅能提高CD的生物相容性，还能提高CD进入细胞的效率．经生物功能化后，TAT-CD-PEG-FA仍然具有较小的水合动力尺寸，并且带电性呈中性，可将此TAT-CD-PEG-FA应用于细胞内．

2.4 细胞成像

将未修饰FA的碳点TAT-CD-PEG和生物功能化碳量子点TAT-CD-PEG-FA分别与HeLa细胞共培养，经2组实验对比验证TAT-CD-PEG-FA 上的FA能通过癌细胞表面的FA受体实现对TAT-CD-PEG-FA的快速内吞和TAT-CD-PEG-FA的细胞核靶向作用．通过共聚焦显微镜观察所制备的TAT-CD-PEG-FA在2组细胞实验中癌细胞受体介导内吞的功能与细胞核靶向的能力．在共聚焦显微镜成像结果(见图5)中，蓝色荧光为碳量子点荧光，绿色荧光为细胞核染料Syto 9的荧光．可以看出，TAT-CD-PEG与HeLa细胞培养4 h后细胞质中出现明显的CD蓝色荧光；12 h后细胞核中CD的蓝色荧光明显增强．而TAT-CD-PEG-FA与HeLa细胞培养2 h后细胞质中已出现明显的碳量子点蓝色荧光，6 h后细胞核中出现明显CD蓝色荧光，12 h后细胞质与细胞核中碳量子点蓝色荧光相对6 h时无明显变化．实验结果表明，CD修饰FA使癌细胞更易于摄取CD，提高了CD进入细胞的速度，而TAT的修饰使CD具有细胞核靶向的功能．

(a) Zeta电位

(b) DLS

(c) MTT实验

图4 物理化学性质表征

(a) TAT-CD-PEG与细胞培养2 h

(b) TAT-CD-PEG与细胞培养4 h

(c) TAT-CD-PEG与细胞培养6 h

(d) TAT-CD-PEG与细胞培养12 h

(e) TAT-CD-PEG-FA与细胞 培养2 h

(f) TAT-CD-PEG-FA与细胞 培养4 h

(g) TAT-CD-PEG-FA与细胞 培养6 h

(h) TAT-CD-PEG-FA与细胞 培养12 h

图5 细胞成像荧光共聚焦图片

3 结论

1) 碳量子点具有良好的荧光性质且具有低毒性、生物相容性好和易于表面修饰的特点，使得碳量子点在细胞内离子、生物分子的检测与细胞荧光成像方面的应用有着明显的优势．对碳量子点进行功能化，不仅能提升碳量子点的性质，还能赋予碳量子点特殊功能，扩展碳量子点在各个领域中的应用．

2) 本文合成了荧光性质优异的碳量子点，为了使碳量子点在细胞荧光成像分析中的应用更为广泛，对预先羧基化处理的碳量子点通过共价修饰的方式进行了生物功能化．PEG，TAT和FA的修饰分别赋予了碳点良好的生物相容性、细胞核靶向和易于被癌细胞摄取的能力，成功制备了生物功能化碳量子点(TAT-CD-PEG-FA)．该生物功能化的碳量子点具有电中性、小尺寸、低毒性的特点和细胞核靶向的能力，并且能够实现细胞内的荧光成像分析．

3) 良好的物理化学性质保证了生物功能化碳点有望被用作纳米示踪剂，可实现细胞内的癌症标志物或特殊药物靶点的高分辨原位荧光成像分析．该生物功能化碳量子点可作为纳米载体，实现对抗癌药物指定位置的运输，达到“精准医疗”的目的．

DOI:10.1039/c6ra11660d.

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