雌激素对去势骨质疏松症大鼠骨密度和骨代谢影响的实验研究

许闫严 张克良 魏忠民 沈波

武汉市第四医院 华中科技大学同济医学院附属普爱医院西院骨一科，湖北 武汉 430000

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种与年龄、性别、环境、遗传等相关的退行性疾病。女性绝经后患骨质疏松症的概率要远大于男性，主要是由于雌激素缺乏所导致[1]。雌激素的缺乏将导致患者骨代谢紊乱、破骨细胞分化因子增加、未成熟的肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)增多及骨髓间充质干细胞减少，这些变化最终导致骨吸收与骨生成平衡被打破，造成骨微结构破坏、骨量减少、骨强度下降，从而导致骨质疏松[2-4]，据此越来越多的学者通过摘除卵巢的方法来制备骨质疏松症动物模型[5-6]。在临床研究中，对雌激素治疗绝经后女性骨质疏松症的研究大多仅限于临床疗效的观察上。例如，黎涛等[7]使用雌激素联合抗骨质疏松药物治疗绝经后女性骨质疏松症具有显著的临床疗效。而相关作用机制研究鲜有报道，尤其是骨密度(bone mineral density，BMD)和骨代谢方面。因此，笔者于2015年9月至2016年3月利用去卵巢骨质疏松症模型的大鼠进行研究，旨在通过补充雌激素的刺激作用，观察其对去卵巢骨质疏松症模型大鼠骨密度和骨代谢的影响，探讨雌激素治疗绝经后女性骨质疏松症的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组与造模

所有动物实验严格遵守实验动物伦理条例。选用雌性健康的SD大鼠48只，鼠龄5～6个月，体重(245±24)g，未曾交配，购自于湖北省实验动物中心。将SD大鼠随机分成4组：对照组(12只)、模型组(12只)、雌激素组(12只)和雌激素+三苯氧胺组(12只)。对照组，即假手术组，在手术过程中只暴露卵巢而不切除，随后立即进行缝合处理；其他各组大鼠采用双侧卵巢摘除法制备骨质疏松症模型。手术方法：使用3%戊巴比妥(注射量按大鼠体质量计算)腹腔注射麻醉处理，沿背部正中左右两侧软肋下剪开皮肤，切口长约2.0 cm，向一侧分离皮肤筋膜及腹膜脏层，暴露腹腔，找到子宫后确认双侧卵巢。对照组保留双侧卵巢，其他各组大鼠进行结扎及摘除两侧整个卵巢组织，分层缝合后，外层皮肤消毒。手术过程中无大鼠死亡，术后所有大鼠均臀部肌肉注射青霉素(200万U/kg)预防术后感染，注射3 d，每日1次，手术后自由摄食和摄水。

1.2 给药及取材

手术一个月后开始给药。雌激素组给予尼尔雌醇(北京四环制药有限公司)灌胃(按体质量计)，用药剂量[8]为1 mg/kg，生理盐水配制，1次/w；雌激素+三苯氧胺组给予尼尔雌醇(1 mg/kg)和三苯氧胺(山东健康药业有限公司，用药剂量[9]为3 mg/kg)灌胃，生理盐水配制，1次/w；对照组和模型组分别使用等量生理盐水灌胃。持续3个月，每周称量体重1次，并按照体重变化调整给药量。给药前每组随机采用10%水合氯醛(3 mL/kg)注射麻醉6只大鼠，分别取血及剥离胫骨及股骨组织保存。给药3个月后，对剩下所有大鼠(每组6只)进行一次眼球取血3～5 mL，-20 ℃保存。取血后，10%水合氯醛注射麻醉(3 mL/kg)，在无菌条件下取大鼠右后肢胫骨及股骨干骺端，剥离附着的肌肉及解体组织，充分暴露股骨头，用消毒后的老虎钳将胫骨、股骨头钳碎，分别放入无菌的EP管中，-80 ℃保存。

1.3 指标检测

1.3.1血清生化指标的测定：取血液3 mL，3 000 r/min 离心15 min，取血清。采用原子吸收分光光度计测定血清钙含量；采用酶联免疫法测血清总碱性磷酸酶(alkaline phosphates，ALP)、血清抗酒石酸酸性磷酸酶-5b(tartrate resistant acid phosphatase-5b，TRAP-5b)的含量，ALP及TRAP检测试剂盒均由上海生工提供。

1.3.2骨骼钙的测定：取右后腿胫骨并剥离附着在胫骨上面的肌肉及解体组织，将骨头置于90 ℃烘箱中烘5～6 h后，碾碎并称其质量(约1 g)，缓慢将碾碎的胫骨置于刻度均一的离心管中，加入8 mL硝酸，放置于摇床(低速)上过夜，将95 ℃水浴锅中加热至溶液清澈透明，用超纯水定容至50 mL。取样品1 mL稀释1 000倍，测定骨骼中钙的含量。

1.3.3骨矿物盐含量的测定：将大鼠股骨放入烤箱，105 ℃烤干至恒重后称量为干重，烤干后的样品放入灰化炉650 ℃灰化 36 h，取出称量为灰分重量，矿盐含量为灰分重量与干重之比。

1.3.4骨保护素(osteoprotegerin，OPG)和核因子κB受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factor-κ B ligand，RANKL)蛋白表达的检测：将大鼠左侧胫骨组织进行常规脱钙，包埋、切片、脱蜡、用双氧水灭活内源性酶，进行高温高压修复3 min，山羊血清封闭液室温封闭1 h，滴加OPG(CST，1∶100)及RANKL(CST，1∶100)一抗孵育过夜，滴加生物素二抗室温孵育2 h，滴加链霉亲和素-生物素复合物试剂，二氨基联苯胺显色后，苏木素轻度复染，脱水、透明、封片，显微镜观察。细胞胞浆着色呈现棕黄色为阳性表达，每张切片随机选取10个视野，采用图像分析系统测定着色部位的平均光密度值，作为OPG及RANKL蛋白的表达强度。

1.3.5骨密度的测定：使用美国GE公司生产的LunarDPX-Prodigy双能X线骨密度测量仪测定大鼠左侧股骨的骨密度值。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠血清钙及骨骼钙含量的检测结果

给药前与对照组比较，模型组、雌激素组和雌激素+三苯氧胺组血钙含量显著升高(P<0.05)，骨钙含量显著降低(P<0.05)。给药治疗后与给药前比较，雌激素组血钙含量显著降低(P<0.05)，骨钙含量显著上升(P<0.05)，模型组和雌激素+三苯氧胺组差异无统计学意义(P>0.05)。给药后与模型组比较，雌激素组血钙含量显著降低(P<0.05)，骨钙含量显著上升(P<0.05)，而雌激素+三苯氧胺组差异无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠血清钙、骨骼钙给药前后含量比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组相比，◆P<0.05；给药后与给药前相比较，▲P<0.05。

2.2 大鼠骨代谢相关生化指标的检测结果

给药前与对照组比较，模型组、雌激素组和雌激素+三苯氧胺组血清ALP含量差异无统计学意义(P>0.05)，血清TRAP-5b含量显著升高(P<0.05)。给药治疗后与给药前比较，雌激素组血清ALP含量显著升高(P<0.05)，TRAP-5b含量显著降低(P<0.05)，模型组和雌激素+三苯氧胺组差异无统计学意义(P>0.05)。给药后与模型组比较，雌激素组血清ALP含量显著升高(P<0.05)，TRAP-5b含量显著降低(P<0.05)，雌激素+三苯氧胺组差异无统计学意义(P>0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠给药前后骨代谢生化指标比较

注：与对照组相比较，*P<0.05；与模型组相比，◆P<0.05；给药后与给药前相比较，▲P<0.05。

2.3 各组大鼠股骨骨密度及骨矿物盐含量的检测结果

给药前与对照组比较，模型组、雌激素组和雌激素+三苯氧胺组BMD和骨矿物盐含量显著降低(P<0.05)。给药后与给药前比较，雌激素组BMD和骨矿物盐含量显著升高(P<0.05)，模型组BMD和骨矿物盐含量则继续显著降低(P<0.05)，雌激素+三苯氧胺组差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后与模型组比较，雌激素组BMD和骨矿物盐含量显著升高(P<0.05)，雌激素+三苯氧胺组BMD和骨矿物盐含量差异无统计学意义(P>0.05)。详见表3。

表3 各组大鼠给药前后左侧股骨BMD值和骨矿物盐含量比较

注：与对照组相比较，*P<0.05；与模型组相比，◆P<0.05；给药后与给药前相比较，▲P<0.05。

2.4 大鼠胫骨中OPG和RANKL蛋白表达测定

与对照组比较，模型组和雌激素+三苯氧胺组OPG蛋白显著下调(P<0.05)，RANKL蛋白显著升高(P<0.05)；雌激素组OPG蛋白和RANKL蛋白则无显著性变化。与模型组比较，雌激素组OPG蛋白显著升高(P<0.05)，RANKL蛋白显著降低(P<0.05)；而雌激素+三苯氧胺组OPG蛋白和RANKL蛋白则无显著性变化(P>0.05)。详见表4。

表4 各组大鼠胫骨OPG和RANKL蛋白表达平均光密度值比较Table 4 Comparison of the mean optical density of OPG and RANKL protein expression between

注：与对照组相比较，*P<0.05；与模型组相比，◆P<0.05。

3 讨论

去卵巢后大鼠所引起的生理学上的变化与绝经后妇女相似，而这一变化主要是由于体内雌激素缺乏所致。有研究表明，当雌激素缺乏时会引起骨中钙的结合能力减弱，导致破骨细胞的吸收作用增强，骨质丢失速度加快，引起骨量减少[10]，最终导致骨质疏松症的发生，而这些也是导致绝经后女性人群骨质疏松症高发的一个重要原因。据2009年一项流行病学调查结果显示[11]，绝经后女性发生骨质疏松的概率为9.4%～37.9%，远高于绝经前女性的1.8%～3.2%。通过补充雌激素治疗绝经后女性骨质疏松症或许是一个潜在的治疗方法，早在1972年Aitken等[12]就在动物模型中尝试使用雌激素治疗骨质疏松症，发现雌激素能够促进新骨的形成。现如今，雌激素类药物在骨质疏松的治疗中被广泛运用，并具有一定的疗效。

现代医学认为绝经后骨质疏松症是因雌激素匮乏导致骨重建失衡引起的高转换型代谢性骨疾病。有研究表明[13]，雌激素缺乏可导致成骨细胞和破骨细胞的比例失衡，骨吸收作用增强，骨形成减少，最终导致骨量丢失。本研究的结果显示，与对照组比较，去势骨质疏松症模型大鼠血钙含量明显增加，骨钙含量显著减少。经过雌激素治疗后，大鼠血钙含量则显著降低，骨钙含量明显增加，而采用雌激素受体拮抗剂三苯氧胺与雌激素灌胃治疗并未显著降低血钙含量和显著增加骨钙含量。且治疗后雌激素组大鼠与骨吸收相关标志物TRAP-5b水平显著低于模型组，骨形成标志物ALP则显著高于模型组，而雌激素+三苯氧胺组与模型组比较差异无统计学意义。说明雌激素治疗可以通过阻止去势骨质疏松症大鼠骨骼钙的流失，从而促进骨形成。治疗后与治疗前比较，模型组中ALP水平也呈现上升趋势，根据骨代谢中骨吸收增加与骨形成动态平衡原理，可能是由于骨吸收的增强而导致的代偿性骨形成增加所致[14]。另外，骨密度和骨矿物盐含量的检测结果显示，模型组大鼠的股骨骨密度和骨矿物质盐含量显著低于对照组，而雌激素治疗后，能够显著提高大鼠股骨骨密度和骨矿物质盐含量，但雌激素+三苯氧胺组则未显著提高大鼠股骨骨密度和骨矿物质盐含量。说明雌激素对提高骨密度和防止骨矿物盐流失具有极大的促进作用。

OPG/RANKL/RANK信号系统是破骨细胞分化成熟过程中的调控枢纽和关键的信号途径[15]，RANK和RANKL结合可导致破骨细胞前体分化和成熟，而OPG能够和RANK竞争性地结合RANKL，间接地降低破骨细胞的活性和分化，在骨量调节中起着重要的作用[16-17]。本研究结果显示雌激素组大鼠骨中OPG蛋白表达量要高于模型组，而RANKL蛋白表达量则低于模型组，而雌激素+三苯氧胺组与模型组比较，OPG和RANKL蛋白表达无显著性变化。这充分说明雌激素能够提高OPG蛋白表达，有利于与RANKL竞争性结合，降低破骨细胞的活性和分化，对抑制骨质疏松的形成起着重要作用。

本研究充分说明雌激素可以通过提高骨密度及骨矿物含量，降低骨转化，对去势骨质疏松症的治疗具有明显的疗效。但本研究还存在不足之处，例如本研究的实验对象仅为雌性去势SD大鼠，存在一定的局限性；且有研究表明长期应用雌激素会对子宫等骨骼外的器官造成不良影响，可导致子宫内膜癌等生殖系统癌症[18]，使雌激素在骨质疏松症的治疗上蒙上了一层阴影。因此，为了让雌激素更好地应用于骨质疏松症的治疗，还需要更多的探索。