一种注射桑树冬芽转化方法的初探

林天宝，刘 岩，计东风，朱 燕，魏 佳，吕志强

（浙江省农业科学院 蚕桑研究所，浙江 杭州 310021）

桑树是一种重要经济林木，在食品、医药保健、茧丝绸和生态等领域都具有重要作用［1～2］。长期以来，桑树主要通过杂交和多倍体育种方式进行品种改良，虽然已经选育多个优良品种，但由于桑树生长周期长，遗传杂合性高，传统的育种方法往往需要花费漫长时间，并且很难做到对有价值遗传性状的定向育种［3～5］。

随着现代分子生物学的发展，建立稳定的遗传转化系统，导入优良的外源基因，将有利于定向提高桑叶的产量和质量，增强桑树抗病性和抗逆性的研究［5～8］。桑树上最早的转基因报道是日本学者Machii等［9］利用农杆菌LBA4404浸染桑树叶片，诱导获得GUS组织化学染色阳性的不定芽。此后，陆小平等［10～11］对桑树幼苗子叶腋隙进行刺伤，接种感染工程农杆菌，利用GUS基因、Km记恨做探针的检测到较强的杂交信号；王洪利等［12］利用桑树茎尖的转化法报道由初步研究结果。Vibha［13］在印度桑（Morus indica L.cv.K2）中过表达大麦（barley）胚胎发育晚期丰富蛋白家族成员HVA1，证实转基因植物耐旱、耐盐和抗寒性都得到改善［14～15］。2011 年，Manaswini等将Osmotin蛋白基因转入K2印度桑中，转基因植物对干旱、盐胁迫以及真菌胁迫表现出更强的耐受性［16］。然而除印度桑外，其他关于桑树转基因研究的报道仍相对较少，特别是国内实用果桑品种的遗传转化方面。西南大学李镇刚等人［17］利用花粉介导的转基因方法进行了研究；以及近年陆续有报道利用桑树转基因毛状根的诱导和繁殖方法、病毒介导的基因沉默的研究探索等；但总体上，采用转基因技术进行桑树遗传育种的研究尚处于起步阶段，还亟需开展更多地探索和研究。

为此，本文选择萌动期的桑树冬芽，以注射方法转化携带β-glucuronidase（GUS）和卡那霉素（Kan）报告基因的重组农杆菌，对冬芽处理枝条的叶片进行GUS酶活性染色和特异性片段的PCR扩增鉴定，以及果实的GUS染色、桑种子的卡那霉素抗性筛选研究。结果证实通过该方法能筛选到阳性转基因桑树植株，这为今后开展桑树功能基因研究和品种改良选育提供了参考。

1 材料与方法

1.1 实验菌株

携带β-葡萄糖甘酸酶基因（GUS）和抗卡那霉素（Kan）报告基因的根癌农杆菌菌株（GV-pBI121）由浙江省农科院沈国新研究员惠赠。所含标记基因GUS受花椰菜花叶病毒的35S启动子控制。

1.2 农杆菌的培养

取保存菌种接种在含有卡那霉素（Kan 100 mg·L-1）和利福平（Rif 50 mg·L-1）两种抗生素的LB培养基上，置于28℃恒温培养箱内培养，挑取单菌落，接种于含有卡那霉素（50 mg·L-1）和利福平（50 mg·L-1）的液体LB培养基，置28℃恒温下震荡培养（200 r·min-1）至菌液浓度（OD600=0.5）时备用。

1.3 供试桑树品种及浸染转化

试验用台湾果桑品种72C002由本课题组基地栽培和保存。选择冬芽即将萌发前作为微注射转染时期。取上述菌液，室温离心15 min（4000 r·min-1）。弃上清，用等量体积的浸染缓冲液（MES 0.25g·L-1，Myo-inositol 0.10g·L-1，MS with Gamborg Vitamins 2.22g·L-1，L-glutamine 0.20g·L-1，D-galactose 1.80g·L-1，pH 5.0）悬浮农杆菌。利用1 ml注射器将农杆菌浸染液注射入桑树冬芽，每芽0.1 mL。注射完成后，取铝箔纸包住枝条，暗处理48 h后，剥离铝箔纸，继续培养。分别采集农杆菌注射后枝条生长的叶片、桑果和桑种子做后续检测分析。

1.4 GUS酶活性显色

GUS酶活检测方法参照文献［18］，取检测样品置于X-Gluc（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄醛酸）染色液（phosphate buffer 50 mmol·L-1，pH 7.0，Ferrocyanide 3 mmol·L-1，Ferricyanide 3mmol·L-1，Triton X-100 0.2 mmol·L-1，X-Gluc 2 mmol·L-1）中，真空泵反复抽气3次后，置于37恒温箱染色过夜。然后弃去染色液，加入70%乙醇脱去样品叶绿素，观察并记录样品染色结果。

1.5 DNA抽提及GUS基因的扩增

利用Omega植物基因组抽提试剂盒提取桑树叶片、对照植株叶片的DNA，分别作为PCR反应的模板。根据GUS基因核苷酸序列设计一对引物（GusF：5‘-CGT CCT GTA GAA ACCCCA ACCC-’；GusR：5‘-ATGCCATGTTCATCTGCCCAGT-3’）。根据KOD-Plus-Neo（TOYOBO公司，日本）酶说明，配制PCR反应体系，反应程序：94℃预变性4 min后，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸90 s。共循环35次。PCR反应产物用1%琼脂糖凝胶电泳，并在紫外灯下观察、拍照。

回收琼脂糖凝胶上对应大小的特异性条带，并委托上海铂尚生物技术公司进行测序检测。

1.6 冬芽处理组桑果的检测

采摘冬芽处理枝条上结出的桑果，收集桑种子并烘干。用100 g·L-1次氯酸钠对桑籽进行消毒处理［19］后播种于含 100 mg·L-1的Kan 1/2 MS 培养基上。观察并统计种子的萌发情况

1.7 数据分析

利用SPSS的平均数单因素方差分析方法，对试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 桑树冬芽的转化

以萌动期桑树72C002的冬芽为研究对象（图1A），经70%酒精擦拭消毒后，每个冬芽注射重组农杆菌0.1 ml（图1A，1B）。一周后，观察芽尖开始转绿（图1C）；继续观察至第三周时，芽尖上新叶长大，开始逐渐伸展张开。这时观察到由于受注射农杆菌的影响，叶片叶尖和部分有萎黄卷曲表型出现（图1D）。

图1 注射浸染桑树冬芽及芽头早期的生长Figure 1 Progress of mulberry winter bud injection and its initial growth

2.2 PCR扩增检测

冬芽处理8周后，随机从6个冬芽生长的枝条上采叶片，抽提取样品DNA后，利用GUS基因特异性引物进行扩增。从PCR的扩增产物电泳结果（图2）可知，有四组样品扩增到预计大小条带，另外2个处理后的叶片样品仅扩增得到非特异性的杂带；同时，正常未处理对照植株来源的叶片样品检测，扩增均未获得与GUS基因大小相对应的片段。扩增产物纯化后送铂尚公司测序，证实扩增序列与目标基因GUS一致。

图2 转基因桑树叶片的PCR扩增检测Figure 2 PCR measurement of the leaves of transgenic mulberry

图3 转基因桑树叶片和果实的GUS染色观察Figure 3 GUS staining of the leaves and fruits from transgenic mulberry tree

图4 转基因桑树种子的抗性筛选Figure 4 Resistance selection of transgenic mulberry seeds

2.3 冬芽处理枝条的GUS酶活性检测

随机选取20个注射冬芽长出的枝条，分别采集靠近枝顶端已经完全张开的叶片，进行GUS染色。其中有9个枝条上叶片呈现出GUS酶着染的蓝色结果，主要显示在叶片叶脉附近（图3A，3B）。

采摘不同冬芽枝条上结的桑果10个进行GUS酶活性染色，在其中2个桑果上观察到GUS的表达主要在果柄和部分果肉细胞（图3C，3D）。

2.4 桑籽的抗性筛选

采集GUS染色阳性10个枝条上的桑果，同一冬芽来源的枝条上的桑果混合在一组，流水反复冲洗收集桑籽后，将采集好的桑籽置于30℃烘箱烘干。经消毒后散播在含100 g·L-1卡那霉素的1/2 MS培养平板上，25℃恒温培养10天。结果发现不同组间发芽率（图4）从0～16.67%不等，平均7.61%，组间偏差极显著（P＜0.01）。

3 讨论

目前，非转基因的桑树育种方法在生产应用广泛，人们利用这些传统的杂交、嫁接、多倍体诱导等技术，已选育出很多性能优良的实用化品种。但为了加快品种选育速度，提高选育的针对性，桑树转基因技术的探索一直备受关注［14］。本研究中，我们采用注射方法将重组农杆菌导入桑树冬芽，对转基因桑树的GUS酶活性染色、特异性外源基因片段的扩增和抗性筛选检测外源基因已经进入转基因桑树（图2～4），GUS阳性检测率达45%；抗性筛选获得的转基因种子萌发率平均为7.61%。但研究还同时发现，GUS染色检测阳性率与基因组DNA进行的PCR反应率间阳性率不一致，推测这可能与检测样本间差异以及检测方法的灵敏度不同有关。

本研究针对不同转化枝条获得桑籽的抗性筛选发芽率差异较大（图4），已发芽的幼苗叶片抽提基因组DNA进行的PCR反应却未扩增到靶片段。分析可能与楼程富等［20］研究提出的未经愈伤处理的新芽组织很难被T-DNA整合有关，因为农杆菌很难穿过角质层和排列紧密有序的表皮细胞去完成贴壁反应。Machii等［21］1996年利用基因枪轰击桑树悬浮愈伤组织，研究检测到GUS阳性，但最终并未能获得转基因植株。

在农杆菌浸染桑树品种的选择上，已报道的桑树转基因主要有新一之濑、丰驰桑、白桑M5［3］、印度桑 K2［14，16］，不同桑树品种的遗传转化适应性存在差异；纵使在组织培养时，我们前期研究也发现适合川桑、滇桑、药桑、印度桑无菌幼苗茎段和生根培养体系存在差异，并且培养基中激素浓度小幅变化都会对其繁殖系数造成明显影响［22］。这些都提示今后可以利用更多的桑树品种来进一步优化转化体系；但本研究方法操作简单，这对今后桑树实用品种的遗传研究具有意见借鉴参考意义。