164例抗核抗体斑点型阳性者血清抗核抗体谱聚类分析

罗雯斌，王晔恺，于 倩，林奇龙

（舟山医院检验中心，浙江 舟山 316000）

自身抗体是针对自身组织、器官、细胞及细胞成分的抗体，是自身免疫性疾病（autoimmune disease，AID）的重要标志[1]。临床上比较常见的自身抗体检测项目包括抗核抗体（antinuclear antibody，ANA）、ANA谱和抗双链DNA（double-stranded DNA，ds-DNA）抗体，这3项指标检测相对方便，也是AID的重要标志物[2]。ANA虽然本身不能单独诊断任何疾病，但对于系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）、混合性结缔组织病（mixed connective tissue disease，MCTD）、干燥综合征（Sjögren's syndrome，SS）等疾病具有重要的支持诊断和预后判断意义[3]。斑点型作为ANA核型中的重要组成部分，在诊断上述疾病中有着非常重要的意义。为了探讨ANA斑点型阳性者血清ANA谱的特征，本研究通过聚类分析研究ANA斑点型阳性者不同类型ANA的聚类现象以及不同类别与实验室指标的相关性，为临床诊断AID提供依据。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2014年8月—2016年8月舟山医院门诊和住院患者中ANA斑点型阳性者164例，其中男38例、女126例，年龄（53.6±11.2）岁，经临床明确诊断，符合中华医学会风湿病学分会和美国风湿病学会（American College of Rheumatology，ACR）的诊断标准[4-5]，包括类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）57例、 SLE 29例、SS 60例、MCTD 18例。采用非抗凝真空管采集所有患者静脉血4 mL，静置30 min后，894×g离心10 min，分离血清。

1.2 方法

1.2.1 全血细胞测定 采用LH750全自动血液分析仪（美国Beckman-Coulter公司）及配套试剂检测白细胞（white blood cell，WBC）、血红蛋白（hemoglobin，Hb）和血小板（platelet，PLT）。

1.2.2 抗环瓜氨酸肽（cyclic citrullinated peptide，CCP）抗体测定 抗CCP抗体采用金标法测定，试剂盒购自上海科新生物技术有限公司，严格按试剂说明书操作。

1.2.3 生化及免疫指标测定 采用AU640全自动生化分析仪（日本Olympus公司）及配套试剂检测丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、总胆红素（total bilirubin，TB）、球蛋白（globulin，GLB）、肌酐（creatinine，Cr）、尿素水平。采用IMMAGE 800全自动特定蛋白分析仪（美国Beckman-Coulter公司）及配套试剂检测抗链球菌溶血素O（anti-streptococcal hemolysin O，ASO）、类风湿因子（rheumatoid factor，RF）、C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）、免疫球蛋白A（immunoglobulin A，IgA）、免疫球蛋白M（immunoglobulin M，IgM）、免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）、补体（complement，C） 3、C4。

1.2.4 ANA测定 分别采用间接免疫荧光法（indirect immunofluorescence，IIF）和免疫印迹法平行检测ANA和ANA谱。在IIF测定中，抗体效价≥1∶100即视为ANA阳性。在免疫印迹法测定ANA谱中，筛查抗nRNP/Sm、抗Sm、抗SS-A、抗Ro-52、抗SS-B、抗Scl-70、抗PM-Scl、抗Jo-1、抗CENP B、抗PCNA、抗ds-DNA、抗核小体、抗组蛋白、抗核糖体P蛋白和抗AMA-M2抗体。试剂盒均购自德国欧蒙公司，严格按照试剂说明书操作。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行统计分析。首先将ANA抗体谱中定性指标转化为数值，阳性为1，阴性为0，然后采用聚类法进行分类，Mean法验证冰柱图分类的显著性。呈正态分布的数据采用±s表示，多组间比较采用方差分析和LSD检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ANA谱阳性率分析

164例ANA斑点型阳性者经聚类法分类并检验后最终分为3类：A类（120例）以抗SS-A、抗Ro-52、抗SS-B的高阳性率为特征，B类（21例）以抗U1-RNP的高阳性率为特征，C类（23例）以抗Sm、抗核糖体P蛋白、抗ds-DNA、抗核小体、抗组蛋白的高阳性率为特征。见表1。

2.2 A类、B类和C类患者所患疾病的分布

与A类、B类和C类最相关的疾病分别是SS、MCTD和SLE。SS患者多表现为A类，即以抗SS-A、抗Ro-52、抗SS-B抗体阳性为主，差异有统计学意义（χ2=16.38，P＜0.01）；MCTD患者多表现为B类，即以抗U1-RNP抗体阳性为主，差异有统计学意义（χ2=62.59，P＜0.01）；SLE患者多表现为C类，即以抗Sm、抗核糖体P蛋白、抗ds-DNA、抗核小体、抗组蛋白抗体阳性为主，差异有统计学意义（χ2=59.11，P＜0.01）。见表2。

2.3 A类、B类和C类患者实验室指标的比较

B类患者抗CCP抗体阳性率显著高于A类和C类患者（P＜0.01）。C类患者Cr、IgG、GLB高于A类和B类患者，而WBC则低于A类和B类患者（P＜0.01）。其他各项指标各组间差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表1 A类、B类和C类患者ANA谱阳性率的比较 [例（%）]

表3 A类、B类和C类患者实验室指标的比较

3 讨论

AID是一种自身免疫细胞、因子过度活化，自身抗体大量产生造成的多器官广泛损伤的慢性疾病，近年来其发病率呈逐步上升趋势[6]。作为AID诊断5个依据之一的血清ANA也逐渐受到临床的关注[7]。聚类分析能通过离差平方和法将同质的疾病或患者群进行归类分析，以便于后续的观察，特别适合于临床表现复杂、自身抗体表现众多的AID。

斑点型又称为核颗粒型、核斑块型。分裂期细胞核质染色呈斑点型、斑块状，核仁阴性，分裂期细胞染色质阴性。根据相关文献报道，斑点型是ANA众多荧光模型中阳性率最高的[8]。本研究结果显示，对ANA阳性者进行聚类分析后发现能初步分为高抗SS-A、抗Ro-52、抗SS-B类，高抗U1-RNP类和高抗Sm、抗核糖体P蛋白、抗ds-DNA、抗核小体、抗组蛋白类。这3类人群中的主要代表性疾病分别为SS、MCTD、SLE。这提示检测ANA谱组合有助于临床对AID的诊断和鉴别诊断。另外，利用自身抗体的出现可能早于（甚至提前10年）临床症状的出现和发病这一特点，可以有针对性地预测相应疾病[9]。RF不能用聚类分析的方法获得特征性的抗体组合，这可能与RF既能单独又能伴随其他AID发生有关[10]。

本研究结果显示，B类患者抗CCP抗体阳性率明显高于A类和C类患者。这可能是由于抗CCP抗体是RA的血清标志物，而MCTD是一种同时或不同时具有SLE、多发性肌炎、硬皮病、RA等疾病混和表现的疾病，不少患者存在与RA类似的关节骨质破坏的症状，所以抗CCP抗体在MCTD患者中有较高的阳性率，与文献报道[11]一致。同时还提示抗CCP抗体可能有助于SS、MCTD、SLE的鉴别诊断。本研究结果还显示，C类患者存在低水平的WBC和高水平的IgG、Cr，提示这类SLE高发人群可能存在较高风险的肾和血液系统损伤[17]，需进行针对性治疗，防止进一步恶化为尿毒症或造血危象。同时，C类患者高GLB水平提示体内可能存在广泛的免疫系统紊乱，并通过免疫复合物等途径诱导炎症，造成多器官、多系统损伤[13]。

综上所述，对ANA斑点型阳性者进行血清ANA的谱聚类分析研究有助于临床提高AID的检出率并给予及时的对症治疗。