豚鼠尿道Cajal间质细胞在交感神经诱发平滑肌收缩中的作用研究*

王江平，王勤章，焦 勇，许志斌△

1.空军军医大学唐都医院泌尿外科(西安 710038)，2.石河子大学医学院第一附属医院泌尿外科(石河子 832000)

主题词 尿道/生理学 Cajal间质细胞 交感神经 平滑肌 豚鼠

尿道平滑肌收缩可以产生足够的尿道压力，在排尿和射精过程中起着重要的作用。由于尿道平滑肌收缩是由自主神经兴奋引起的，探索尿道的神经信号的调控机制是研究后尿道压力异常引起诸如前列腺增生症、早泄等相关疾病的热点之一。近年来，在尿道中发现一种在形态和免疫学上类似于胃肠道Cajal间质细胞(Interstitial cells of Cajal，ICC)的特殊细胞被称为尿道ICC[1-2]。在胃肠道，ICC不仅充当平滑肌自主兴奋的起搏器，同时也作为“信号中转站”介导神经信号至平滑肌，参与平滑肌活动的调控[3-4]。交感神经是尿道平滑肌主要的兴奋性神经，本研究通过形态学和功能学研究初步证实豚鼠尿道ICC具有介导交感神经信号，调控尿道平滑肌收缩的功能，现报道如下。

材料与方法

1 材 料 成年豚鼠5只，体重350～500 g。大鼠抗小鼠c-Kit抗体(1∶200；Millipore，美国)，兔抗小鼠-actin抗体(1∶400；Abcam，美国)，兔抗DβH抗体(1∶200；Santa Cruz，美国)，兔抗α1-肾上腺受体(1∶400；Abcam，美国)，兔抗Cx-43抗体(1∶400；Abcam，美国)，FITC 标记的羊抗大鼠抗体(1∶200；北京中杉金桥)和TRITC标记的羊抗兔抗体(1∶200；北京中杉金桥)，Glivec (诺华，瑞士)。

2 方 法

2.1 免疫荧光染色实验：①腹腔内注射50 mg/kg 戊巴比妥钠将豚鼠麻醉后处死，立即解剖、取出后尿道；②将后尿道组织包埋，冰冻切片机上制作20 μm 切片，贴附于载玻片上，在4 ℃丙酮中浸泡15 min；③用1∶100胎牛血清封闭，孵育80 min，分别滴加c-Kit抗体和-actin抗体混合液，c-Kit抗体和DβH抗体混合液，c-Kit抗体和α1-肾上腺素受体抗体混合液，c-Kit抗体和Cx-43抗体混合液，在4 ℃环境中孵育12 h；④加FITC和TRITC标记的混合二抗，置于25 ℃湿盒内避光孵育60 min；⑤封片后置于激光共聚焦显微镜下观察，FITC激发波长为488 nm，TRITC激发波长为543 nm，使用Zeiss LSM 软件保存、分析图片。

2.2 体外肌条实验：50 mg/kg 戊巴比妥钠腹腔注射麻醉豚鼠后，取后尿道组织，在Kreb液中漂洗后持续给予97% O2和 3% CO2。每只豚鼠取5 mm×2 mm×1 mm肌条各2条，两端丝线固定，一端固定于孵育槽底部，一端连接于张力换能器上，给予1 g负荷，孵育1 h。张力换能器信号输入四通道生理记录仪，加入50 μmol/L的去甲肾上腺素诱发肌条收缩，记录肌条收缩的频率和幅度曲线15 min。向孵育槽中分别加入50、200 μmol/L的Glivec抑制尿道肌条ICC功能后，分别记录肌条收缩的频率和幅度曲线各15 min。

3 统计学方法 每只豚鼠取2个，共10个尿道肌条，肌条实验记录每个肌条收缩的频率和幅度，采用配对t检验对使用不同浓度的Glivec前、后各组数据采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1 免疫荧光染色实验结果 免疫荧光标记实验显示在豚鼠尿道平滑肌层内发现大量的c-Kit阳性细胞，这些c-Kit阳性细胞和胃肠道ICC的一般形态学特征相似，细胞呈纺锤形或星形(图 1)，胞体约20 μm，细胞两端有明显细长的突起，细胞浆染色，少量细胞浆包绕在细胞核周围，细胞核大，呈椭圆形，位于细胞中央，占细胞大部分2/3以上体积且未被c-Kit抗体标记、染色(图 2，3)。DβH染色阳性的交感神经纤维一呈网络状分布(图 1)。尿道ICC和平滑肌束走形方向一致，和交感神经纤维一起伴行呈网络状平行分布，两者之间存在密切接触(图 1)。尿道ICC与平滑肌细胞也密切接触(图 2)，ICC肌动蛋白染色阴性(图 2)。免疫荧光双标记染色还显示在c-Kit标记阳性的ICC上还同时表达交感神经递质去甲肾上腺素的α1-肾上腺受体以及缝隙连接蛋白Cx-43(图 3)。

A、D：尿道中的 c-Kit阳性ICC(绿色)；B、E：尿道中的DβH阳性交感神经纤维(红色)；C、F：亲密关系交感神经纤维和ICC之间存在密切的形态学联系(白色箭头)

A、B：ICC(绿色)位于尿道平滑肌纤维束(红色)之间，与平滑肌细胞边缘密切接触

2 体外肌条实验结果 50 μmol/L的去甲肾上腺素可以稳定地诱发尿道肌条收缩，收缩幅度为(1.26±0.15g)，收缩频率为 (2.55±0.27) min-1。使用50、200 μmol/L Glivec 抑制ICC功能后尿道肌条的收缩幅度为(0.85±0.11)g、(0.38±0.07)g。使用50、200 μmol/L Glivec抑制ICC功能后尿道肌条的收缩频率为(2.52±0.19)min-1、(2.66±0.29)min-1。Glivec明显降低了尿道肌条收缩的幅度(P<0.01)，但对收缩的频率未产生显著影响 (P>0.05) (图 4)。

A、D：尿道中的 c-Kit阳性ICC(绿色)。B：α1-肾上腺受体(红色)在尿道中的表达。E：Cx-43(红色)在尿道中的表达。C：尿道中c-Kit和α1-肾上腺受体共表达(橙色)。F：尿道中c-Kit和Cx-43共表达(黄绿色)。

A：应用50 μmol/L Glivec 后NE诱发的尿道肌条收缩活动的变化；B：应用200 μmol/L Glivec 后NE诱发的尿道肌条收缩活动的变化；C：Glivec可以降低NE诱发尿道肌条收缩的幅度(P<0.01)；D：Glivec对NE诱发尿道肌条收缩的频率无明显影响(P> 0.05)

讨 论

在胃肠道，ICC插入肠神经纤维及平滑肌细胞之间，传递、介导神经信号，调控平滑肌活动。胆碱能神经元、P物质阳性神经元等兴奋性运动神经元都与ICC之间存在密切的形态学联系[5-7]。和胃肠道不同，尿道平滑肌活动的兴奋性神经元为交感神经，探索交感神经、ICC、平滑肌细胞之间的形态学联系对于研究尿道平滑肌张力调控机制具有重要的意义。在本研究中，我们发现大量c-Kit阳性ICC位于尿道平滑肌束之间，和交感神经、平滑肌细胞关系密切，三者之间组成“交感神经-ICC-平滑肌”结构单位，这种类似胃肠道ICC介导神经信号的结构单位提示尿道ICC可能具有介导交感神经信号调控平滑肌活动的作用。

在胃肠道，神经纤维和ICC之间的连接结构为突触样连接。作为突触后膜，ICC细胞膜上表达包括毒蕈碱受体(M2、M3)、神经激肽受体(NK1、NK3)、肠血管活性肽受体(VIP-1，VIP-2)等多种神经递质的受体[8-9]。去甲肾上腺素是尿道内兴奋性交感神经的神经递质，主要通过刺激α1-肾上腺受体引起平滑肌收缩。本项研究发现尿道ICC细胞膜上表达α1-肾上腺素受体，说明ICC为临近交感神经纤维的靶细胞，交感神经纤维可能通过突触样连接将神经信号传递给ICC。

本研究发现豚鼠尿道ICC位于平滑肌肌束之间，和肌束边缘的平滑肌细胞密切接触，为尿道ICC介导神经信号至平滑肌细胞提供了形态学证据。在胃肠道，连接ICC与平滑肌细胞的分子结构为缝隙连接。缝隙连接蛋白Cx-43是缝隙连接的重要组成部分。这些缝隙连接允许第二信使以及离子等非渗透分子进行膜间自由转移来传递来进行细胞间通讯。在胃肠道，ICC能通过这些低电阻通路迅速传递各种神经信号至平滑肌细胞[10]。本研究表明，ICC位于尿道平滑肌束边缘，和平滑肌细胞密切接触，并且表达Cx-43，提示尿道ICC具有将神经信号向临近平滑肌细胞传递的结构和分子基础，但Cx-43是否就是ICC将交感神经信号传递至平滑肌细胞的特殊通道仍需深入研究。

c-Kit是ICC特异性标记物，抑制c-Kit可以抑制ICC的发育、起搏和神经信号传递功能。Glivec是c-Kit特异性的抑制剂，常被用作研究ICC功能的工具性药物[11]。本研究中我们使用Glivec可以抑制去甲肾上腺素诱发的尿道平滑肌收缩幅度，提示在肌条实验中抑制ICC功能后交感神经递质诱发的尿道平滑肌收缩效应也受到了抑制，间接证实了ICC在尿道中介导了交感神经信号，进而调节平滑肌收缩。

综上所述，我们的研究结果提示尿道ICC可能以α1-肾上腺受体和Cx-43为分子结构基础，与交感神经、平滑肌细胞组成“交感神经-ICC-平滑肌”形态、功能单位，发挥介导交感神经信号，调控尿道平滑肌活动的功能，研究结果为深入研究尿道平滑肌调控机制以及尿道平滑肌异常活动相关疾病提供了全新的切入点。