单面针根和叶的代谢组比较研究

贾 浩，孙吉康，王 平，周 韬，吴 艳

（中南林业科技大学 生命科学与技术学院，湖南 长沙 410004）

单面针，又名蚌壳花椒、山枇杷、大叶花椒、铁杆椒等[1-2]，芸香科木质藤本，生长于山地林中，学名岘壳花椒，是一种重要的药用植物，富含生物碱、香豆素、三萜类、黄酮、甾体类、酰胺、苯丙素类等植物有效活性成分，主要治疗腰酸、牙痛、女性经量过多和产后月经不调等症状。现阶段关于单面针药材的研究多数停留在资源分布及生境调查[4-5]、化学成分的含量测定及分离[6-8]及对单面针人工快繁技术的研究[9-13]，对根、茎、叶的化学成分差异以及代谢物合成的生理生化机制鲜有报道。

代谢组学（Metabolomics/Metabonomics）其目的在于对某一生物或细胞在一特定生理时期内所有低分子量（分子质量＜1 000）代谢产物进行成分及其动态变化的研究[14-15]。代谢物与生物的表型最为接近，被称为基因与表型之间的桥梁[16]。代谢组学分析可以指示细胞、组织或器官的生化状态，揭示生物各代谢网络间的关联性。目前，植物代谢组学主要采用4种分析技术，核磁共振谱（Nuclear magnetic resonance，NMR）、毛细管电泳色谱质谱联用（Capillary electrophoresis-mass spectrometry，CE-MS）、气相色谱质谱联用 （Gaschromatography-mass spectrometry，GC-MS） 和液相色谱质谱联用 （Liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）。不同方法检测的代谢物极性和类别不同，因此都不能完全覆盖整个代谢组的化合物，但是鉴定的代谢物有部分重叠[17]。近年来，研究人员也正尝试整合不同的分析技术，以期望能将各种优势结合起来，以弥补单一技术分析的不足。最先与代谢组学相关的文章是利用气相色谱质谱（GC-MS）技术来分析尿液和组织的提取物的代谢[18]。由于GC-MS的灵敏度高、分辨率高、重现性好、成本相对较低和具有大量的标准代谢物谱图库的优势，很适合对低极性、低沸点、相对分子质量小或衍生化后能挥发的物质进行分析，也成为当前植物代谢组学研究的一个主要分析技术之一。本研究将根、茎与叶的HPLC图谱比对分析以了解根、茎、叶在成分上的总体差异，并采用GC-MS对根与叶进行代谢组学比较分析以深入了解根与叶在有效成分上的差异，同时结合KEGG通路了解可能的代谢物合成途径，为单面针药用资源的进一步开发利用奠定基础。

1 仪器与材料

UV-2450紫外分光光度计（日本SHIMADZU）；Thermo台式高速冷冻离心机；超声波细胞粉碎机（BRANSON Digital Sonifier）；AL204电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；Aquapro超纯水仪（AWJ1-2002-UT）；DFY-01万能粉碎机（温岭市林大机械有效公司）。Agilent气相色谱质谱联用仪（7890A-5975C）。

单面针药材采自张家界市走马坪地区，经中南林业科技大学喻勋林教授鉴定为芸香科花椒属单面针Zanthoxylum dissitum Hemsl 4年生可药用植株。

2 方 法

2.1 样本分组、提取分离

将单面针样本叶设为A组，根设为B组。实验分别编号为A1～A10，B1～B10，即每组10个平行。精密称取植物60 mg于1.5 mL的离心管中，随后加入40 μL内标（L-2-氯-苯丙氨酸，0.3 mg/mL。甲醇配置）和360 μL冷甲醇后匀浆（Tissuelyser-48中研磨，60 HZ，2 min）；匀浆液使用超声波提取30 min后加入200 μL氯仿和400 μL H2O，再次在超声波下提取30 min，低温条件下离心10 min（14 000 rpm/min，4 ℃），将离心后所得上清液取700 μL装入玻璃衍生瓶中，用快速离心浓缩仪挥干后在往其中加入80 μL甲氧胺盐酸吡啶溶液（15 mg/mL），用涡旋震荡仪震荡2 min，转移至37 ℃的震荡培养箱中肟化反应90 min，反应后取出，往其中加入20 μL正己烷和80 μL衍生试剂BSTFA（含1%TMCS），用涡旋震荡仪震荡2 min后于70℃条件下反应60 min。取出样本，在室温条件下放置30 min，进行GC/MS代谢组学分析。

2.2 GC/MS及数据分析

取衍生化的提取物1 μL，采用GC-MS系统的无分流模式进行分析。样品在经过与db- 5ms毛细管柱（30 m × 250 μm I.D., J&W Scientific, Folsom,CA）分离之后再进入质谱分析。分析包括GC /MS的样本信息、质量谱响应强度和保留时间-质量核比。对于样本本质谱峰的响应强度采用峰面积归一化法来进行规格化，得到归一化的数据矩阵，再使用无监督主成分分析（PCA）来观察各个样本之间的总体分布情况及整个分析过程的稳定性。

2.3 差异代谢物的筛选及鉴定

采用单维分析（t检验）和多维分析（O）PLS-DA变量权重值相结合的方法对与组间的差异代谢物（VIP＞1，P＜0.05）进行筛选。并将每个化合物的特征离子片段谱（Fragmentation patterns）的丰度与碎片质荷比同Feihn代谢组学数据库、NIST数据库进行比对，完成差异代谢物的鉴定，并将最终比对结果的匹配度超过70%的检测物认为是标准物质。通过使用MBRole（http://csbg.cnb.csic.es/mbrole/）网站的ID转换功能和MBRole通路分析功能，利用已知的根与叶的差异代谢物，获得差异代谢物的KEGG的物质 ID，再利用差异代谢物的KEGG ID进行KEGG通路的显著富集（P＜0.05）分析。

3 结 果

3.1 单面针药材根、叶代谢物组间差异分析

比较GC/MS的样品信息、保留时间-质核比和质谱响应强度，使用峰面积归一化法对样本质谱峰的响应强度进行归一化。将归一化后的数据，进行降维处理，以消除多信息共存中的重叠部分而提取出主要成分进行分析。采用正交偏最小二乘法判别（OPLS-DA）分析，使A、B组间得到最大程度的分离，并有效降低组内平行样本的差异，结果见图1。可见A、B组平行样本均明显分开，表明根与叶的代谢物具有明显的差异。

3.2 筛选鉴定根、叶间差异代谢物并进行KEGG通路富集分析

采用2.3方法筛选鉴定差异代谢物并利用MBRole网站进行KEGG化合物匹配以及KEGG通路富集分析。基于代谢物峰面积进行A、B组样本t 检验，得到峰面积具有显著差异的差异代谢物，其中与KEGG化合物匹配的有77个（表1）。将这77个代谢物基于代谢物信息数据库（KEGG）进行KEGG通路富集分析（表2）。

图1 单面针叶(A组)、根(B组)的OPLS-DA图Fig. 1 OPLS-DA of leaves(A group) and roots (group B) of Zanthoxylum dissitum Hemsl

表1 经鉴定的单面根与叶的差异代谢物Table 1 Identified metabolites of different content between roots and leaves

分析表2数据，可见差异代谢物主要富集于苯丙酸类的生物合成途径（map01061）、类黄酮合成途径（map 00941、map01061）、谷胱甘肽合成途径（map 00480）、三羧酸循环途径（map 00020）、β-丙氨酸代谢途径（map 00410）、莽草酸途径合成生物碱（map 01063）。本研究对苯丙素类生物合成途径（map01061，图2）和莽草酸途径合成生物碱（map 01063，图3）进行了分析，并将代谢物在根、叶中的不同含量按照如下规律在图中标注颜色（根中含量更高的代谢物为红色，叶中含量更高的代谢物为蓝色，含量无显著差异的代谢物为绿色）。

图2 苯丙素类的生物合成途径(map01061)Fig. 2 Biosynthesis of phenylpropanoids(map01061)

表2 单面针根与叶间差异代谢物富集的KEGG通路Table 2 Enriched KEGG pathway of metabolites of different content between roots and leaves

苯丙素类的生物合成途径（图3）显示在叶中三羧酸循环代谢的重要中间代谢物柠檬酸，异柠檬酸、酮戊二酸含量都显著高于根中，而且在叶中谷胱甘肽含量也显著高于根，表明叶中的谷胱甘肽合成途径以及三羧酸循环代谢途径的活跃度高于根。

本研究表明:根与叶中生物碱类或类黄酮物质的合成各有偏重，但从已鉴定的差异代谢物的种类及其功能看，具有抗菌、抗炎成分的代谢物在根和叶中虽都有存在，但主要存在于根中，在叶中存在很少；具有清除自由基、抗氧化功能的代谢物主要存在于叶中。如苯丙素类的生物合成途径（map01061，图2）中，属于香豆素类（coumarin）的莨菪亭（scopoletin）、苯丙素类（phenylpropanoids）的阿魏酸（ferulate）、类黄酮（flavonoids）的二氢槲皮素（dihydroquercetin）根中含量均高于叶中。莨菪亭有祛风、抗炎、止痛、祛痰作用；阿魏酸有抗凝血、抗炎作用；二氢槲皮素则对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、痢疾杆菌和伤寒杆菌有较强的抑菌作用。而儿茶素（catechin），柚皮素（Naringenin）在叶中含量更高。柚皮素既具有抗菌、抗炎的功能，也具有清除自由基、抗氧化等活性，儿茶素是茶叶的重要成分，有清除自由基、抗氧化等功能。

莽草酸途径合成生物碱（map 01063，图3）中，以苯丙氨酸（phenylalanine）为前体合成的香兰素（vanillin）、酪胺(tyramine)在根中含量较高。左旋多巴(l-dopa)、N-甲基氨基苯甲酸（Methylanthranilic acid）在叶中含量更高。香兰素具有镇静及抗癫痫作用；酪胺具有收缩子宫、收缩末梢神经及升高血压的生理作用；左旋多巴经多巴脱羧酶脱羧而转变成多巴胺发挥作用，同时也是异喹啉类物质的前体物质；N-甲基氨基苯甲酸多作为邻氨基苯甲酸母核生物碱的前体，是吖啶碱或喹啉类物质的前体物质。

图3 莽草酸途径合成生物碱(map 01063)Fig. 3 Biosynthesis of alkaloids derived from shikimate pathway(map 01063)

4 讨论与结论

花椒属植物是传统的食用、药用植物，含有多种植物有效成分，主要包括挥发油、生物碱、酰胺、香豆素、木质素、脂肪酸等，具有多种药理功效，如抑菌抗病毒作用、驱虫杀虫作用、对镇痛抗炎、抗溃疡、止痒等作用[19]。随着研究技术及研究方法的不断进步，以及代谢组学方法的不断革新，花椒属各个属的果实、种子、根、茎以及叶片的各个部位的生理活性物质都逐渐被人们所探知，其药理学功能也不断被认知，因此花椒属植物的药品开发将具有巨大的潜力和深远的意义[20]。

马英姿等[2]从单面针的根中提取的中性亲脂性成分具有良好的抑菌作用，并从单面针中性亲脂性成分中分离得到2种香豆素:佛手内酯和异虎耳草素属于香豆素类。香豆素是一类具有多种生物活性如抗凝血、抗HIV、抗癌、抗真菌等作用的小分子化合物[21-22]。比较莨菪亭与异虎耳草素和佛手内酯的结构（图4），发现具有极为相似的内核结构，显示单面针中有多种香豆素类物质作为重要的有效成分。

图4 佛手内酯、异虎耳草素和莨菪亭的化学结构式Fig. 4 The chemical ctructure bergapten, isopimpinellin and scopoletin

肖灿等[23-24]对单面针茎中有效成分进行分离得到两面针碱、血根碱、花椒棚碱。韦瑀龙等[25]在单面针种鉴定出花椒碱、大叶桉亭、茵芋碱、香豆酰酪胺、橙黄胡椒酰胺5个生物碱。肖灿等[23]、韦瑀龙等[25]、袁园[26]、马英姿等[27]都鉴定出了白藓碱。这些生物碱主要属于喹啉类生物碱。与生物碱生物合成有关的主要氨基酸有鸟氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、邻氨基苯甲酸、组氨酸等。单面针代谢组差异代谢物富集的通路中主要有苯丙氨酸-酪氨酸母核类型生物碱（如本研究鉴定的莨菪亭、阿魏酸、香兰素、酪胺），邻氨基苯甲酸母核生物碱（如本研究鉴定的N-甲基氨基苯甲酸）两类生物碱的合成。苯丙氨酸-酪氨酸母核类型生物碱有苯丙胺类、苄基苯乙胺类、异喹啉类、吐根碱等类型；邻氨基苯甲酸母核生物碱有喹啉类、吖啶酮类、喹唑啉等类型。

本研究气相色谱-质谱法测定的代谢组数据，反应了单面针早期次生代谢物的生成情况，揭示了在单面针的根茎部、叶片中存在较大的成分差异。如叶中的谷胱甘肽合成高于根，而且三羧酸循环的中间代谢物如柠檬酸，异柠檬酸、酮戊二酸含量更高，这些中间代谢物可以作为合成其他分子的碳链骨架，显示叶中的生物合成代谢更为活跃。另外，根或叶都有生物碱类或类黄酮物质的合成。但是从已经鉴定的具体物质看，具有抗菌、抗炎的生物碱、类黄酮物质在根中含量更高些；而叶中含量更高的代谢物多具有清除自由基、抗氧化等功能。而这一结论与王丽美等[28]对不同部位的单面针药材HPLC图谱研究的结论相吻合，这为我们进一步研究单面针有效药用成分及其生物合成提供了参考。本研究阐述了单面针的根茎及叶的成分差异，但对其成分的分析仍然停留在基础性的研究上，对具有生物活性成分的及其中的构效关系并不明朗，有待进一步的探索研究。