3株紫花苜蓿内生根瘤菌功能差异性分析

康文娟，师尚礼,2,3,4，王泽一，陈建纲,2，苗阳阳

(1.甘肃农业大学草业学院，甘肃 兰州 730070； 2.草业生态系统教育部重点实验室，甘肃 兰州 730070;3.甘肃省草业工程实验室，甘肃 兰州 730070； 4.中-美草地畜牧业可持续研究中心，甘肃 兰州 730070)

植物内生菌(endophyte)是指在某一生活阶段或整个生活史生存于健康植物组织器官内部或细胞间隙，与宿主植物互惠共生而不引起病症的细菌或真菌[1-3]。随着根瘤菌在非豆科植物组织中被发现分离后，又被发现存在于豆科植物的茎和种子中[4-5]，根瘤菌也被划入内生菌的范畴。近年来，有关内生菌的研究主要包括植物内生细菌的分离和鉴定、生物学功能分析、定殖过程的探索以及菌种的利用。Subramanian等[6]报道指出，植物内生细菌与促生菌(PGPR)同时接种对豆科植物结瘤和固氮效率有促进作用。

关于苜蓿(Medicago)根瘤菌的研究已有很多报道，然而这些报道主要是从苜蓿根瘤、土壤或者种子中分离根瘤菌，对除种子外植物组织内生根瘤菌的研究报道则主要集中在其促生能力、生物多样性[7]、对生物和非生物逆境的抗性[8-9]、在植株体内数量分布和运移动态[10-13]等方面，而在根瘤菌株共生固氮能力方面报道较少。本研究通过对3株组织内生根瘤菌株抗逆性、促生以及共生能力的研究，旨在比较分析组织内生根瘤菌株的功能差异，为紫花苜蓿(Medicagosativa)内生根瘤菌的开发与利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1试验地概况 试验于2014年在甘肃省会宁县东七里铺和甘肃农业大学兰州牧草试验站内进行，样地基本概况如表1所列。

表1 样地概况Table 1 General situation of sampled plots

1.1.2苜蓿品种 两个供试苜蓿品种已生长两年，分别为甘肃本地品种“陇中”和引进美国的WL168HQ(表1)，植株生长健壮、无病害。选用WL168HQ为接种苜蓿品种，由甘肃农业大学草业生态系统教育部重点实验室提供种子。

1.1.3培养基和营养液 根瘤菌株培养采用YMA培养基[5]，活化采用TY培养基[14]；溶磷能力测定采用有机磷蛋黄卵磷脂(EYPC)和无机磷Ca3(PO4)2固体培养基[15]。营养液采用Hoagland有氮及无氮营养液[14]。

1.2 指标测定及方法

1.2.1内生根瘤菌株分离与纯化 于初花期在每个苜蓿品种样地内随机取5株植株，连根挖起装于自封袋冷藏条件带回实验室。清洗植株，晾干表面明水后用无菌剪刀将根分离为根表皮和根中柱，各称取1 g置于无菌三角瓶内，加碘伏(0.45%～0.55%)溶液震荡灭菌3 min，无菌水冲洗5次，加2 mL无菌水在研钵中研磨均匀。将研磨匀浆转入2 mL离心管离心(4 000 r·min-1,10 min),用无菌水依次配置成10-3、10-4、10-5稀释液，取0.2 mL稀释平板法涂抹至含刚果红的YMA培养基上，28 ℃培养48 h，进行内生菌株分离和纯化。具体方法参考文献[11]。

1.2.2内生细菌16S rDNA序列分析 用上海生工细菌DNA提取试剂盒(SK8256)提取内生菌基因组DNA，方法参见试剂盒说明书。扩增引物采用27F(5′-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3′)和1492R (5′-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3′)[16]。PCR反应体系和扩增条件参考文献[16]。PCR扩增产物委托上海生工进行测序，测序的16S rDNA序列提交到GenBank数据库。通过EzBioCloud鉴定服务网站(https:∥www.ezbiocloud.net/)[17]获得与供试菌株序列同源性最高的模式菌株16S rDNA序列，用MEGA 6.0软件进行比对，选用Neighbour-joining法进行UPGMA分析构建系统发育树，Bootstrap法(1 000次重复)检验。

1.2.3表型特性测定 以YMA固体平板培养基为基础培养基，对3株内生根瘤菌进行唯一碳氮源、抗逆性以及生理生化特性测定。唯一碳源测定项目包括苹果酸、肌醇、肌酸、甘露醇、蔗糖、葡萄糖、延胡索酸、琥珀酸、D-果糖和乳糖；唯一氮源包括L-色氨酸、甘氨酸、精氨酸、L-组氨酸和苯丙氨酸；染料抗性测定包括溴百里酚蓝、甲基红、甲基绿、溴酚蓝、亚甲基红、中性红、亚硝酸钠、孔雀石绿、溴甲基绿和刚果红；唯一碳氮源利用和染料抗性测定设定浓度为1%；抗生素敏感性测定包括红霉素、氯霉素、卡纳霉素、氨苄霉素、新霉素、链霉素和庆大霉素，设置浓度梯度为5、50、100和300 μg·mL-1；NaCl的浓度梯度为2%、4%和6%，耐酸碱性测定pH 5、9和11，生长温度范围测定包括8、37和40 ℃。

生理生化试验包括淀粉水解试验、明胶水解试验、产硫化氢试验、VP试验、吲哚试验、接触酶反应、柠檬酸盐试验、3-酮基乳糖反应和BTB产酸产碱反应。菌株接种均设有3个阳性重复和1个阴性对照，除生长温度测定试验在5～7 d后记录菌体生长状况外，其余所有菌株接种后均于28 ℃恒温培养箱中培养，24～48 h后记录菌体生长状况。所有灭菌均采用121 ℃、26 min条件。具体测定方法参考文献[18]。

1.2.4溶磷及分泌生长素(IAA)能力测定 参照文献[19]，采用有机磷蛋黄卵磷脂(EYPC)和无机磷Ca3(PO4)2固体培养基溶磷圈法进行溶磷能力测定，28 ℃培养7 d后测定根瘤菌菌落溶磷透明圈直径与菌落直径的比值(D/d)。参照文献[20]的方法分析菌株分泌IAA的能力。

1.2.5共生结瘤及固氮能力测定 种子处理和培苗：挑选子粒饱满、健康的苜蓿种子数粒，在生物安全柜内用碘伏溶液(有效碘含量0.45%～0.55%)震荡灭菌3 min，用无菌水冲洗5～6次，于清水琼脂中28 ℃催芽48 h。将河沙洗净，pH调至中性后烘干，冷却，在40 mm×250 mm玻璃试管中装入河沙至距底100 mm处，棉塞加盖包扎，121 ℃灭菌26 min。在无菌条件下取出棉塞，每管加入30 mL无菌水。待水完全渗入后，将发芽种子植入试管，每管10粒，加盖棉塞，置于光照培养箱中无菌培养。培养条件为光照度7 000～8 000 lx，光照时间12 h·d-1，有光照时温度21～25 ℃，无光照时温度16～20 ℃，相对湿度50%～70%。在第7天浇灌Hoagland有氮营养液4 mL。

根瘤菌菌液制备和接种：将保存的根瘤菌株接入TY平板培养基活化24 h。再转入YMA液体培养基，160 r·min-1、28 ℃摇床培养至光密度值(OD600值)≥0.5时，10 000 r·min-1离心10 min，抛去上清液后用无菌水洗下菌体，摇匀打散后用无菌水将菌液配制成OD600值为0.5的菌悬液。在幼苗生长第15天时，在无菌条件下用移液枪将制备好的菌液加入幼苗根部，每管4 mL，加棉塞无菌培养。以不含根瘤菌的菌液为对照，每个菌株4个试管作为重复。培养第22和30天，在无菌条件下浇灌Hoagland无氮营养液，30 d后去掉棉塞，然后每隔5 d浇灌一次Hoagland无氮营养液，每管4 mL。

接种效果测定：接种45 d后，收获苜蓿植株并清洗干净，用滤纸吸干水分。每管随机选取3株，测算单株叶片数、单株根瘤数和单株有效根瘤重。以第1片对生子叶叶痕处作为划分地上、地下部分的标准，测定株高和根长；将地上和地下部分剪开后分别包入锡箔纸袋，两端开口，在105 ℃烘箱中烘15 min，再经80 ℃烘干至恒重，分别测定地上和地下干重。将叶片与叶脉分离后称重，用80%丙酮∶95%乙醇=1∶1提取液法测定叶片叶绿素含量；粗蛋白含量采用连续流动分析法[21-22]测定；固氮酶活性采用乙炔还原法[23]测定。

1.3 数据分析

采用SPSS19.0进行统计分析，测定结果用平均值和标准误表示，对不同菌株接种处理分别进行单因素方差分析，采用Duncan法进行多重比较，采用Excel 2010制表。

2 结果

2.1 内生菌的分离及鉴定结果

在初花期，对两个苜蓿品种植株上根表皮和根中柱的内生细菌进行分离，由16S rDNA系统发育分析可知，仅有3株内生菌(WLP2、WLG1和LP3)属于中华根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)，在系统发育树上与模式菌株SinorhizobiummelilotiLMG 6133T形成独立分支(图1)，序列相似性分别为98.42%、97.63%和97.26%。菌株WLP2、WLG1和LP3分别分离自WL168HQ和陇中苜蓿，分离部位包括根表皮和根中柱，直径分别为5.5、5.0和4.5 mm，均为半球形突起、乳白色半透明形态(表2)。现由甘肃农业大学草业生态系统教育部重点实验室保存。

表2 供试菌株来源及形态特征Table 2 Sources and morphological characteristics of tested strains

图1 16S rDNA系统发育分析树Fig. 1 Phylogenetic tree based on 16S rDNA analysis

2.2 表型特性

3株内生根瘤菌均能利用供试的10种碳源以及精氨酸、L-组氨酸和苯丙氨酸，产硫化氢和过氧化氢，不代谢3-酮基乳糖，符合根瘤菌的表型特征描述[23](表3)。72 h之内均在YMA培养基上形成直径≥4 mm的单菌落，BTB反应产酸，符合快生型根瘤菌的特征[5]。

在10种供试染料中，3株内生根瘤菌均不能耐受溴酚蓝(表4)。就耐受抗生素能力而言，3株菌均能耐受≤100 μg·mL-1的红霉素和庆大霉素以及≥300 μg·mL-1的氯霉素和氨苄霉素。其中菌株WLP2能耐受≥300 μg·mL-1的氯霉素、卡那霉素、氨苄霉素、新霉素和链霉素，WLG1能耐受≥300 μg·mL-1的氯霉素和氨苄霉素，LP3能耐受≥300 μg·mL-1的氯霉素、氨苄霉素、新霉素和链霉素。表明WLP2菌株抗生素耐受范围最广。

表3 菌株唯一碳氮源利用及生理生化特性Table 3 Sole carbon and nitrogen utilization and biochemical characteristics of the strains

+，菌株反应阳性；-，菌株反应阴性。下同。

+, strains showed positive reaction; -, strains showed negative reaction; similarly for Table 4.

从抗盐性上看(表4)，菌株WLP2可耐受6%的盐胁迫，WLG1和LP3仅可耐受4%的盐胁迫；耐受酸碱性方面，WLP2和WLG1能在pH 5～11的YMA培养基上生长，LP3不能耐受pH 11的环境；耐受高低温方面，WLP2和LP3均能在8～40 ℃的温度下生长，WLG1不能耐受8 ℃的低温。表明3株菌株中WLP2对盐、pH和温度的适应范围最广，其次为WLG1和LP3。

2.3 菌株溶磷及分泌IAA能力

3株内生根瘤菌溶磷和分泌IAA能力不同(表5)。在溶磷方面，菌株WLG1和WLP2能溶解有机磷，D/d值分别为1.21和1.07，前者比后者溶解有机磷能力强；LP3不能溶解有机磷。菌株WLP2能溶解无机磷，D/d值为1.29，溶解无机磷能力比溶解有机磷能力强；WLG1和LP3都不能溶解无机磷。就分泌IAA能力而言，菌株WLP2能够分泌IAA，菌株WLG1和LP3没有分泌IAA的能力。综上所述，菌株WLP2既能溶磷又能分泌IAA，促生能力较强;菌株WLG1溶解有机磷能力最强。

2.4 共生结瘤及固氮能力

2.4.1结瘤能力和固氮酶活性 3株内生根瘤菌接种，紫花苜蓿植株的结瘤效果不同(表6)。与对照相比，3株菌株接种对单株结瘤数均有促进作用，WLG1结瘤效果最好(25.67个)，单株结瘤数比对照(8.33个)高208.16%，差异显著(P<0.05)；WLP2(19.67个)和LP3(13.67个)单株结瘤数虽然分别比对照高136.13%和64.11%，但与对照差异不显著(P>0.05)。从单株有效根瘤重看，3株菌株均与对照差异不显著(P>0.05)，WLG1(15.50 mg)比对照(14.53 mg)增加了6.68%；LP3(10.60 mg)和WLP2(9.73 mg)单株有效根瘤重分别比对照降低了27.05%和33.04%。表明接种WLG1菌株幼苗结瘤能力最强。

就根瘤固氮酶活性而言(表6)，WLP2效果最好[10.00 μmol·(g·h-1)]，根瘤固氮酶活性比对照[0.31 μmol·(g·h-1)]高3 125.81%，显著高于其他处理(P<0.05)；菌株WLG1[0.30 μmol·(g·h-1)]和LP3[0.00 μmol·(g·h-1)]分别比对照降低了3.23%和100%，均与对照差异不显著(P>0.05)。表明菌株WLP2接种根瘤固氮酶活性最强。

2.4.2植株生长和生物量 就株高而言，菌株WLP2(18.43 cm)和LP3(15.17 cm)接种，株高分别比对照(15.00 cm)高22.87%和1.13%，WLG1株高(12.50 cm)比对照低16.67%，三者均与对照差异不显著(P>0.05)(表7)。就根长而言，虽然菌株LP3(9.67 cm)、WLG1(9.50 cm)和WLP2(9.37 cm)接种，根长分别比对照(8.67 cm)高11.53%、9.57%和8.07%，但与对照差异不显著(P>0.05)。

3个菌株接种幼苗生物量不同(表7)。就地上干重而言，菌株WLG1(139.43 mg)接种比对照(80.90 mg)高72.35%，差异显著(P<0.05)；WLP2(124.37 mg)和LP3(102.10 mg)接种分别比对照高53.73%和26.21%，均与对照差异不显著(P>0.05)。就地下干重而言，菌株WLG1接种(96.87 mg)比对照(43.57 mg)高122.33%，显著大于其余处理(P<0.05)；WLP2(48.40 mg)接种比对照高9.98%，LP3(27.37 mg)接种比对照低37.18%，二者均与对照差异不显著(P>0.05)。表明菌株WLG1接种植株生物量最高。

表4 菌株抗逆性Table 4 Tolerances of the strains

表5 菌株溶磷及分泌生长素(IAA)能力Table 5 Abilities of the strains to solubilize phosphate and secrete IAA

D/d，溶磷指数；D，溶磷圈直径；d，菌落直径；+++，菌株能够分泌IAA。

D/d, phosphate-dissolving index; D, phosphate-dissolving ring diameter; d, colony diameter; +++, strains could secret IAA.

2.4.3单株叶片数、叶绿素含量和粗蛋白含量 就单株叶片数而言，菌株WLP2(15.67株)和WLG1(14.33株)接种单株叶片数分别比对照(9.33株)高67.95%和53.59%，LP3接种单株叶片数(8.00株)比对照低14.26%，均与对照差异不显著(P>0.05)(表8)。就叶绿素含量而言，菌株WLP2接种(3.53 mg·g-1)比对照(2.21 mg·g-1)高59.73%，差异显著(P<0.05)；而WLG1(1.79 mg·g-1)和LP3(1.73 mg·g-1)接种分别比对照低19.00%和21.72%，与对照差异不显著(P<0.05)。

从粗蛋白含量看，各处理之间差异显著(P<0.05)。与对照相比，WLP2接种粗蛋白含量最高(13.77%)，其次为LP3(12.21%)，分别比对照(10.88%)高26.56%和12.24%；而WLG1接种粗蛋白含量(9.44%)比对照低13.24%，且显著低于其他处理(P<0.05)。表明菌株WLP2接种紫花苜蓿单株叶片数、叶绿素和粗蛋白含量较高(图2)。

表6 接种不同内生根瘤菌的紫花苜蓿单株根瘤数、有效根瘤重及固氮酶活性Table 6 Nodule number per plant, effective nodule weight and nitrogenase activity of alfalfa plants inoculated with different endophytic rhizobia

同列不同小写字母表示菌株处理间差异显著水平(P<0.05)。表7、8同。

Different lowercase letters within the same column indicate significant difference among strain treatments at the 0.05 level; similarly for Table 7 and Table 8.

表7 接种不同内生根瘤菌的紫花苜蓿株高、根长、地上干重及地下干重Table 7 Height, root length, and aboveground and belowground dry weight of alfalfa plants inoculated with different endophytic rhizobia

表8 接种不同内生根瘤菌的紫花苜蓿单株叶片数、叶绿素和粗蛋白含量Table 8 Leaf number, Chlorophyll and crude protein content of alfalfa plants inoculated with different endophytic rhizobia

3 讨论

土壤盐碱化是影响农业生产和生态环境的一个重要因素，温度是影响根瘤菌生长的重要生态因子，因此筛选耐盐碱性强，温度适应范围广的苜蓿内生根瘤菌有重要意义。有研究表明，种子内生根瘤菌有很强的耐盐性，能适应偏酸或偏碱的生长环境，适应pH值范围很广泛；能在10～35 ℃之间生长，能耐短时的高温[24]。供试的组织内生根瘤菌株WLP2能在6% NaCl、pH 5～11和8～40 ℃的环境下生长，菌株WLG1和LP3均能耐受4%NaCl，前者可以在pH 5～11和温度为37～40 ℃的环境下生长，后者能在pH 5～9和温度为8～40 ℃的环境下生长，与以上研究结果一致。说明组织内生根瘤菌株对盐、pH和温度的适应范围广泛,在抵御外界生物及非生物环境压力方面比根际其他微生物更具优势[25]。祁娟和师尚礼[24]研究指出，部分种子内生根瘤菌最高耐盐量达10%，能耐pH为4和12以及4 ℃的低温环境，说明对于组织内生根瘤菌株在高盐、强酸碱和极温环境下的抗逆性研究意义重大。

图2 3株内生根瘤菌接种紫花苜蓿幼苗Fig. 2 Medicago sativa seedlings after inoculation with three endogenous rhizobia

许多微生物具有将植物难以吸收利用的磷转化为可吸收利用形态的能力[26]。研究表明不同品种紫花苜蓿种子内部根瘤菌溶解有机磷的溶磷圈直径比在2.567～1.117，只有一株菌(SL01)能够溶解无机磷[24]。试验中菌株WLG1和WLP2能形成透明圈，均可分泌一些酸性物质，在培养基中扩散后使菌落周围的磷酸盐溶解[27]，前者溶解有机磷的直径比为1.21，溶磷能力中等，后者直径比为1.07，溶磷能力很弱。就溶解无机磷能力而言，3株菌中仅有菌株WLP2能形成透明圈，直径比为1.29。不同形态磷酸盐的结构和成分存在差异，所有微生物对其溶解程度不同[28]。本研究只对菌株的磷酸钙-无机磷溶解能力进行了定性测定，为了全面评价菌株溶磷能力，有必要对其他有机或无机磷源进一步测定。

植物生长激素IAA可促进植物根系生长，提高植物对养分的吸收。据报道大多数根际微生物[29]和禾本科植物联合固氮菌株[28]具有分泌植物激素的能力，祁娟和师尚礼[5]研究也表明73%的种子内生根瘤菌株能够分泌IAA，而本研究中仅有1株组织内生根瘤菌WLP2分泌IAA能力强。除菌株本身的因素外，这可能与菌株WLP2具有溶解有机磷和无机磷的能力有关，而土壤磷素含量的提高有利于提高菌株分泌IAA的能力[30]。

根瘤菌对苜蓿幼苗共生结瘤、固氮能力的影响与菌株基因型、苜蓿品种和生态环境有关[31]，不同菌株接种效果有差异。与此相似，本研究中根瘤菌对幼苗的影响明显受到苜蓿品种的影响，如WL168HQ苜蓿接种菌株LP3后，其单株有效根瘤重、根瘤固氮酶活性、地下干重、单株叶片数和叶绿素含量均低于对照。有研究指出，不能单纯依据固氮酶活性的高低确定根瘤菌的固氮能力，必须综合考虑有效根瘤数、结瘤效率、地上部分干重和环境因素等指标[32]。如本研究在实验室条件下接种菌株WLP2后，虽然根瘤固氮酶活性、幼苗单株叶片数、叶绿素含量和粗蛋白含量均显著高于对照和其他处理，但是单株结瘤数、植株株高、根长、地上和地下干重与对照差异不显著，对苜蓿植株的生长没有明显效应。菌株WLG1接种虽然固氮酶活性、株高、根长、单株叶片数和叶绿素含量与对照差异不显著，但是单株结瘤数、地上干重和地下干重显著高于对照和其他处理，植株生物量最高，表现出良好的接种效果。根瘤菌的固氮效果与土壤密不可分，从土壤中能够筛选出高效根瘤菌，显示环境因素对根瘤菌分布和固氮能力有重要意义[33]。所以有必要通过大田试验测定菌株的共生结瘤和固氮能力，并比较组织内生根瘤菌与非内生根瘤菌的促生能力，以便开发具有不同功能的根瘤菌株。

4 结论

综上所述，内生根瘤菌株WLP2抗生素耐性强，能在6% NaCl、pH 5～11和温度8～40 ℃的环境下生长，溶磷和分泌IAA能力强。菌株WLG1共生固氮能力强，对WL168HQ苜蓿接种效果最佳，均有很好的开发潜力。