种公猪精液携带繁殖障碍性疫病病原的检测与分析

卫朝辉，严玉霖，高飞龙，王世玉，高 洪

（云南农业大学动物科学科技学院，昆明 650201）

养猪业在畜牧产业体系中占有重要地位，随着养猪业集约化、规模化程度的不断提高，人工授精技术也在不断地发展完善并被广泛地应用，成为改良猪品种和育种最直接有效的途径。随之而来的健康公猪精液携带毒传播的问题也日益复杂化和严重化。众多繁殖障碍性疫病病毒都能通过精液水平和垂直传播给母猪和仔猪[1,2]，对养猪业构成了严重的威胁，也给世界各地的畜牧业造成了巨大的经济损失[3]。研究显示，猪繁殖与呼吸综合症病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）、猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）、猪细小病毒（Porcine parvovirus，PPV）、日本乙型脑炎病毒（Japanese B encephalitis virus，JEV）和猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV-2）等病毒均在种公猪精液中被检出[4,5]，是引发猪繁殖障碍性疫病的重要病毒性病原。临床症状主要表现为患病妊娠母猪流产、早产、不孕、产死胎、木乃伊胎及弱仔等，还可以引起哺乳仔猪及保育猪发病或死亡。这几种病原不仅能水平传播，还能通过母猪胎盘和公猪精液垂直传播。可见，种公猪精液是繁殖障碍性疫病病原传播的重要媒介。随着分子生物学技术的发展，快速、高效的分子生物学方法成为繁殖障碍性疾病重要的检测手段。本研究应用RT-PCR/PCR技术对2015~2016年云南省某地区种猪场送检的50份种公猪精液进行了CSFV、PRRSV、PPV、JEV和PCV-2检测，以期了解规模化猪场种公猪精液携带病毒感染情况，为科学预防、控制和净化上述疾病提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 精液样品 50份种公猪精液样品为2015～2016年云南省某规模化猪场送检，－20℃保存备用。

1.1.2 试剂与仪器 DNA提取试剂盒TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒购自北京天根生化技术有限公司；RNA提取试剂盒Trizol试剂盒购自Invitrogen公司；反转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒、DNA Marker购自宝生物工程（大连）有限公司；低温超速离心机购自美国Beckman公司；BIO-RAD PCR仪购自美国BIO-RAD公司；电泳仪（北京六一仪器厂，型号：DYCP-31BN）；凝胶成像紫外仪（北京六一仪器厂，型号：WD-9403F）。

1.2 方法

1.2.1 引物和检测方法 根据GenBank公布的CSFV、PPV、JEV和PCV-2的保守基因核苷酸序列并参考文献[6]，设计合成5对检测引物，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列以及扩增片段长度见表1。CSFV、PRRSV和JEV采用RT-PCR方法检测；PPV和PCV-2采用PCR方法检测。

表1 本研究中RT-PCR和PCR引物Table 1 Primers used for RT-PCR and PCR in this study

1.2.2 精液样品核酸提取及CSFV、PRRSV和JEV的cDNA制备 50份精液样品DNA和阳性毒株DNA提取步骤依照TIANamp Genomic DNA Kit DNA提取试剂盒说明书进行，提取的DNA产物-20℃保存。精液样品RNA提取：吸取250 μL精液样品，加入1 mL Trizol，混匀，室温孵育5 min；加入0.2 mL氯仿，剧烈震荡15 s，室温孵育5 min；4℃、12 000×g离心15 min；取无色的水相层于新的离心管中，加入等体积－20℃预冷的异丙醇，于－20℃静置15 min，4℃、13 400×g离心10 min；弃上清，加入1 mL－20℃预冷并经DEPC处理过的75%乙醇，4℃、10 200×g离心5 min；弃上清，倒扣晾干，将沉淀溶解于40 µL RNA溶解液（ddH2O）中，60℃水浴孵育10 min，立即进行反转录或保存于－80℃备用。

反转录体系20 μL：按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒说明书进行，反转录产物于－20℃保存。

1.2.3 PCR扩增 分别以CSFV、PRRSV、JEV反转录的cDNA和PPV、PCV-2的DNA为底物，进行PCR扩增，反应体系（25 μL）：Mix 12.5 μL、底物2 μL、上游和下游引物各0.5 μL、ddH2O 9.5 μL。扩增程序：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30s，35个循环；72℃再延伸10 min。CSFV进行巢氏PCR扩增，取上述PCR产物1 μL，用引物F1和F3进行二次扩增，反应条件：94℃预变3 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环；72℃再延伸10 min。

1.2.4 电泳 取5 μLPCR扩增产物于1.0%的琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统中进行观察，对结果进行检测。

1.2.5 感染情况的鉴定 对样品分别进行CSFV、PRRSV、PPV、JEV和PCV-2检测。1份样品只能检测到1种病原阳性的为单一感染，同时检测到2种病原阳性的为二重感染，同时检测到3种病原阳性的为三重感染。

2 结果与讨论

2.1 种公猪精液中疫病检测结果 猪繁殖障碍性疫病已成为困扰养猪业健康发展的关键问题，相关研究证明，种公猪精液可作为CSFV的重要传播途径[7]。同时CSFV感染的阳性精液还可垂直感染子代[8]。PRRSV感染种公猪后可在其精液中检测到病毒颗粒[9]。根据CSFV、PRRSV、PPV、JEV和PCV-2病毒的PCR扩增结果，5种疫病中检出率最高的是PPV，送检的50份精液样品中，有4份为阳性，阳性率为8%；其次为PRRSV和PCV-2，有2份为阳性，阳性率达4%；最低的是CSFV和JEV，有1份为阳性，阳性率为2%。结果表明精液是多种病原传播的良好媒介，提示种公猪对于疫病的发生和传播起着重要作用[10]。2015年送检样品中CSFV、PRRSV、JEV和PCV-2检出率均高于2016年，PPV在2016年的检出率高于2015年，差异具有明显统计学意义。具体检测结果见图1和表2。

种公猪精液中可以检测出CSFV、PRRSV、PPV、JEV和PCV-2，PPV是感染猪群的主要疫病，且带毒率高，而CSFV、PRRSV、JEV和PCV-2主要在2015年送检的样品中被检出（表2）。检测结果与黄夏等[11]对广西省部分猪场的精液进行调查和检测的结果相似，但是与彭洁[12]2015年对云南省送检样品主要病原的检测结果相比，阳性率略低。

2.2 精液病毒感染情况 在送检的50份精液样品中，CSFV、PPV和JEV均为单一感染，1例为PRRSV+PCV-2二重感染。2016年PPV的单一感染率最高，为10.71%。2015年CSFV和PPV的单一感染率相同，均为4.55%；2015年PRRSV+PCV-2二重感染1例，为2%。本研究结果表明，2015年和2016年云南省PPV都有很高的单一感染率，猪病的混合感染不多。种公猪静夜中存在繁殖障碍性疫病的相关病毒，应加强对种公猪精液管理，及时淘汰带毒种公猪。

表2 种公猪精液病毒检测结果Table 2 The results of virus infection in boar semen

图1 种公猪精液中疫病病毒检出水平变化Fig.1 Changes of diseases detection in boar semen