欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒反向遗传操作平台的建立

汪 琪，杨海明，汪秀会，刘晓敏，王帅勇，姚 云，朱世强，单同领，童 武，周艳君，李国新，郑 浩，高 飞，姜一峰，童光志，于 海

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241）

猪流感（swine influenza，SI）是一种在猪群中传播的具有传染性的呼吸系统疾病。临床症状主要有食欲下降、咳嗽、发热、衰竭等[1]，发病率高且传播迅速。SI在世界范围内广泛分布，但主要以地方性流行为主[2]。康复猪和隐性感染猪为主要的感染源[3]。近年来，由于养猪业规模的不断扩大，SI流行情况日趋严峻，常伴随“混合感染”，给养猪业带来巨大挑战。

猪流感病毒（Swine influenza virus，SIV）为正黏病毒科、A型流感病毒属的单股负链RNA病毒，其基因组分为8个片段，至少编码12~13种蛋白[4]。根据病毒表面不同的糖蛋白，SIV可分为18种HA亚型以及11种NA亚型[5,6]。目前主要有两种H1N1亚型SIV在猪群中流行，分别为古典H1N1 （classical swine H1N1，CS H1N1）亚型SIV和欧洲类禽H1N1（European avian- like H1N1，EA H1N1）亚型SIV。CS H1N1 SIV在1930年由Shope等在北美的猪群中分离获得[7]。1918~1998年CS H1N1 SIV广泛存在于北美地区，为主要流行的毒株[8]。EA H1N1 SIV于1979年在欧洲被发现，由禽类传入猪群，随后流行于欧洲和亚洲，并逐渐取代CS H1N1 SIV在欧洲的地位[9]。在欧洲和中国都有人感染EA H1N1 SIV并导致死亡的案例报道[10]。2011年，本实验室从天津市分离到1株EA H1N1 SIV，命名为A/ swine/TianJin/6/2013（H1N1）。SIV亚型众多，易发生基因重组和抗原漂移，并可在种间传播，特别是近年来在国内猪群中广泛存在的EA H1N1 SIV，给流感的预防乃至人类的健康带来了众多的挑战。

由于SIV基因组不具有感染性，因此需要从cDNA水平上对病毒进行操作。反向遗传学技术是一门新型技术，首先获得病毒基因组序列，然后对相关靶基因加工、修饰，从而产生具有感染性的病毒粒子，以此来研究病毒的致病机制。本研究建立的EA H1N1 SIV反向遗传操作平台，将为探索SIV的传播机理以及新型疫苗的研制奠定坚实基础。

1 材料与方法

1.1 毒株与载体 欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒A/swine/ Tianjin/6/2013（H1N1）（简称 TJ6）由本实验室分离保存；双向表达载体pBD由中国农业科学院上海兽医研究所李泽君研究员提供。

1.2 菌种与细胞 E.coli DH5α感受态细胞购买自北京天根生物科技有限公司；293T细胞与MDCK细胞由本实验室保存。

1.3 主要试剂 RNA提取试剂盒RNeasy Mini Kit、质粒提取试剂盒QIAprep Spin Miniprep Kit均购自QIAGEN公司；反转录试剂盒SuperScript III Frist-Strand Synthesis System for RT-PCR、DMEM培养基、胎牛血清（FBS）、OPTI-MEM培养基、质体、TPCK-trypsion、Lipofectamine 2000均购自Invitrogen公司；Gel Extraction Kit购自Omega Bio-Tek公司；DNA PolymeraseⅠLarge（Klenow）Fragment、BspQ I限制性内切酶、T4 DNA聚合酶、T4 DNA连接酶均购自NEB公司；高保真酶Pfu UltraⅡ Fusion HS DNA Polymerase 购自Agilent 公司；dNTP、DNA Marker（DL2000）均购自TaKaRa大连宝生物工程公司；公牛血清白蛋白（BSA）购自Promega公司。

1.4 引物设计 对GenBank中公布的H1N1亚型流感病毒序列，参照文献[11]，利用Oligo6.0软件设计合成扩增流感病毒 PB2、PB1、PA、HA、NA、NP、M和NS基因的引物（表1），引物由 Invitrogen公司合成。

1.5 病毒RNA提取、反转录cDNA及目的片段扩增将病毒接种到生长良好的 MDCK细胞中进行增殖，收取上清，按照QIAGEN的RNeasy Mini Kit RNA提取试剂盒说明书提取病毒RNA，利用Invitrogen SuperScript III First-Strand反转录试剂盒将RNA反转录成 cDNA，将此cDNA作为PCR扩增模板，利用Agilent公司的高保真酶Pfu UltraⅡ Fusion HS DNA Polymerase对其8个基因片段进行PCR扩增。

1.6 重组质粒的构建、鉴定及纯化 将经过PCR扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳，切取对应的胶块，并进行胶回收。胶回收产物及双向转录表达载体PBD用BspQ I限制性内切酶酶切5 h，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，并再次胶回收。两次回收产物（目的片段及载体PBD）置于16℃连接仪，过夜连接。将连接产物转化到E. coli DH5α感受态细胞中，取菌液涂于含有氨苄青霉素（50 µg/ mL）的LB平板上，于37℃温箱中培养12~14 h。吸取5 mL含氨苄青霉素（50 µg/ mL）的液体LB培养基于试管中，将挑取的单个菌落接种于试管中，于37℃恒温振荡器内培养14~16 h，取适量菌液进行PCR鉴定。通过琼脂糖凝胶电泳，取PCR鉴定为阳性的菌液进行序列测定。利用QIAGEN的QIAprep Spin Miniprep Kit试剂盒将测序结果正确的菌液进行质粒抽提，测其浓度，保存备用。

表1 病毒全基因组克隆引物Table1 Primers for amplifying the full-length fragments of the virus

1.7 病毒拯救 8种质粒分别按照1000 ng计算，混合在1个EP管中，加入150 µL OPTI-MEM培养基，混匀。20 µL Lipofectamine 2000与150 µL Opti-MEM培养基作用5 min后，加入到混匀的质粒中，室温下作用20 min。先吸取1 mL OPTI- MEM培养基，将生长状态良好的293T细胞洗2遍，再加入上述混合物，放至37℃、5% CO2细胞培养箱中，24 h后添加含5% BSA的 OPTI- MEM培养基，54 h后收取上清，接种到 MDCK细胞上。收取细胞出现明显病变的上清，即为 P1代毒，分装保存。

1.8 拯救病毒的鉴定 通过血凝试验检测P1代毒，同时再次接种MDCK细胞，增殖病毒，为P2代毒。将P2代毒3000×g离心5 min，提取RNA并反转录成cDNA，RT-PCR扩增8个基因片段，通过琼脂糖凝胶电泳及序列测定进行比较。

2 结果

2.1 RT-PCR扩增结果 RT- PCR技术扩增原毒8个基因片段，琼脂糖凝胶电泳得到8个目的基因的电泳条带（图1）。

图1 野生株8个基因片段RT-PCR扩增结果Fig.1 RT-PCR products of eight genes of wild strainM: DNA分子量标准(DL2000); 1: PB2基因; 2: PB1基因; 3: PA基因; 4: HA基因; 5: NP基因; 6: NA基因; 7: M基因; 8: NS基因M: DNA Marker(DL2000); 1: PB2 gene; 2:PB1 gene; 3: PA gene;4: HA gene; 5: NP gene; 6: NA gene; 7: M gene; 8: NS gene

2.2 重组质粒PBD菌液鉴定结果 吸取适量菌液进行PCR鉴定，将鉴定为阳性（图2）的菌液进行序列测定，通过比对，测序结果与精准序列相一致。

2.3 拯救病毒的鉴定结果

2.3.1 细胞病变观察 将在293T细胞上收集的上清接种于生长状态良好的MDCK细胞，48 h后细胞病变不明显。将收集到的细胞上清再次接种于MDCK细胞，48 h后细胞较之前病变明显（图3）。

图2 重组PBD阳性质粒的鉴定Fig.2 The identif i cation of recombinant PBD plasmidsA: PBD-PB2; B: PBD-PB1; C: PBD-PA;D:PBD-HA; E: PBDNP; F: PBD-NA; G:PBD-M; H: PBD-NSM: DNA分子量标准（DL2000）；1~4: 重组质粒M: DNA Marker(DL2000); 1-4: Recombinant plasmids

图3 接种TJ6及rTJ6后MDCK细胞出现的病变Fig.3 The cytopathic effects (CPE) of MDCK cells inoculated with TJ6 or rTJ6A: 正常MDCK细胞; B: 接种TJ6的MDCK细胞; C: 接种rTJ6的MDCK细胞A: Normal MDCK cells; B: MDCK cells inoculated with TJ6;C:MDCK cells inoculated with rTJ6

2.3.2 血凝试验 将P1代毒进行血凝试验，测得血凝效价为24。将P1代毒接种 MDCK细胞，收集细胞病变后上清，为P2代毒。对P2代毒进行血凝检测，测得效价为26，与原始毒株效价相同。

2.3.3 序列比对 对拯救病毒的8个基因片段进行扩增，将胶回收产物进行序列比对，与原始毒株序列比对成功，由此证明病毒拯救成功，命名为rTJ6。

3 讨论

SI是一种急性呼吸道传染病，在破坏呼吸道上皮的防御屏障后，能够与猪2型链球菌、猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒、猪伪狂犬病毒等病毒和细菌继发或混合感染，对养猪业危害极大[12]。另外，由于猪的呼吸道上皮细胞同时具有人和禽流感病毒受体[13]，因此猪既可感染人流感病毒，又可感染禽流感病毒。猪在禽流感、人流感以及猪流感病毒重组的过程中有着“混合器”的作用，具备造成人流感大流行的潜力[14]。因此，监控SI的流行情况十分必要。

EA H1N1 SIV于1979年在欧洲猪群中被发现，随后在欧洲多个国家均被检测到并逐步流行开来[15]。在中国，EA H1N1 SIV也已逐步取代CS H1N1 SIV，占据重要地位[16,17]。1986年，1名接触过猪群的瑞士人首次感染了EA H1N1 SIV。2010年，中国江苏省1名3岁男孩出现了流感样的症状（严重的肺炎）[18]，所分离到的毒株（A/ Jiangsu/ ALS1/2011）与 EA H1N1 SIV在抗原性和基因特性方面有很大的相似性，表明该毒株已具备感染人的能力。研究显示，EA H1N1 SIV对人类受体（SAa-2,6- Gal)的亲和力更高，更容易结合人的受体，在人群中造成流感的爆发[19]。

本研究成功构建8质粒反向遗传操作平台，拯救出所有基因序列与野生株病毒相同的病毒，两者在MDCK细胞上的生长特性保持一致，由此表明拯救病毒具有良好的遗传稳定性。以此为基础，可以在cDNA水平上对流感病毒的基因进行一系列改造，研究基因水平上的改变对病毒的影响[20]。EA H1N1 SIV反向遗传操作平台的成功建立将在研究流感病毒的跨种传播、基因结构、新疫苗研发及预测流感大流行等方面发挥重要作用。