含有WSN病毒基因的重组H9N2亚型流感病毒的复制能力研究

车广胜，崔宏锐，屈梦锦，林伟山，滕巧泱，杨健美，刘芹防，陈鸿军，李雪松，李泽君

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

禽流感（avian influenza，AI）是由正黏病毒科A型流感病毒引起的多种禽类感染的疾病综合征，是一种急性高度接触性传染病，也可感染哺乳动物及人类。水禽是禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）的自然宿主，也是流感病毒的天然基因库，几乎所有亚型的流感病毒都可以在水禽中分离到[1]。根据致病力的不同将禽流感病毒划分为高致病性禽流感病毒和低致病性禽流感病毒。高致病性禽流感病毒对家禽的致死率高，危害明显；而低致病性禽流感病毒常引起呼吸系统局部感染，影响感染禽的生产性能，不发生继发感染时，致死率极低，因此低致病性禽流感病毒很容易被人忽视。但近年来，以H9N2亚型低致病性禽流感病毒为代表，不断与其他流感病毒发生重组，产生新的流感病毒，对人类健康造成巨大威胁。

流感病毒变异率极高，HA和NA基因变异会导致其抗原性改变[2]。导致抗原性变异的原因有基因漂移、基因转换和基因重组。基因漂移（gene drift）是所有流感病毒的共有形式，由HA或NA的点突变造成，变异幅度小，亚型不发生变化；基因转换（gene shift）则是甲型流感病毒的特有形式，为HA或NA的大幅度变异，可以导致亚型改变；基因重组（gene recombinant）为不同种属的流感病毒交换基因，为基因大范围的交换，变异幅度最大，可导致新亚型流感病毒的出现，潜在危害最大。1957年的H2N2亚型流感病毒是人H1N1亚型与欧亚禽源H2N2亚型流感病毒重组产生的新型病毒[3]，其中HA、NA、PB1基因来自禽源，而其他5个基因片段保留人源。H2N2亚型流感病毒的聚合酶基因发生重组，而聚合酶又决定病毒的基础变异速率，因此，该病毒的基础变异速率发生改变，重组的H2N2亚型流感病毒进化速率可能加快[2]。1968年的香港流感H3N2亚型流感病毒，来自禽流感病毒的HA和PB1两个基因节段与流行于人群的H2N2亚型流感病毒的其他6个基因节段发生重组。这种新出现的重组病毒可能在宿主体内流行一段时间后才引起大流行[4]。早期的H3N2亚型流感重组病毒在前几年的流行过程中积累了大量的突变，在1968年和1972年，NA蛋白积累了22个突变，其中9个位于抗原表位[5,6]，说明H3N2亚型流感重组病毒形成后，可能促进病毒NA片段发生突变。同时，重组病毒的HA蛋白让病毒具有逃逸人类现存免疫的能力。某些含有pdm/09内部基因的新型重组犬流感病毒也能感染BALB/c小鼠，并能在小鼠体内较好复制，甚至导致小鼠死亡[7]。Wendel等[8]以H2N2亚型流感病毒为背景，构建H3N2-PB1单基因替换的重组病毒，该重组病毒的聚合酶活性及其在人源细胞上的复制能力均显著增强，同时该病毒可以在豚鼠间进行接触传播。其他聚合酶基因重组的病毒生物活性还未见报道，禽源流感病毒与其他宿主来源的流感病毒之间的重组与流感大流行的确切关系尚有待研究。但值得注意的是，有研究人员发现新型重组病毒H7N9在获得H9N2亚型禽流感病毒提供的内部基因后（PB2、PB1、PA、NP、M、NS）[9]，对人的致病性比H9N2亚型流感病毒增强很多。这说明病毒重组促进H7N9亚型流感病毒内部基因发生了突变，使得其在人类体内复制效率提高，致病性增强[9,10]。

调查研究显示H9N2亚型流感病毒能够感染禽类和哺乳动物，具有广泛的宿主适应性[11]，在亚洲地区广泛流行。H9N2亚型流感病毒在多年的进化过程中也积累很多明显的氨基酸变异[12]，这些变异如果包含了能够促进病毒跨宿主传播、致病性增强或者免疫逃逸的关键位点，则可能通过重组快速产生具有潜在威胁的新型流感毒株。到目前为止已经发现H9N2亚型流感病毒能够与很多其他亚型的流感病毒发生重组，其中包括H6N1亚型流感病毒、H6N2亚型流感病毒和H5N1亚型流感病毒[13,14]，可见H9N2亚型流感病毒具有很大的潜在威胁性。然而，究竟H9N2亚型禽流感病毒的哪些聚合酶基因会对重组毒株的复制能力产生影响，至今未见相关研究报道。为此，本研究以H9N2亚型禽流感病毒（A/Chicken/Shanghai/2093/2009）和WSN毒株（A/WSN/1933(H1N1)）为研究对象，利用反向遗传操作技术拯救多基因替换的重组毒株（r2093HANAPB2/WSN、r2093HANAPB1/WSN、r2093HANAPA/WSN、r2093HANANP/WSN），比较重组毒株与原毒株在MDCK、DF1、A549三种细胞系上的复制情况及其在小鼠体内的复制情况，以期了解不同聚合酶或NP基因在病毒重组中发挥的作用。

1 材料方法

1.1 实验动物、菌种、质粒与细胞株 SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司；SPF级雌性BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司；H9N2病毒株（A/Chicken/Shanghai/2093/2009）和WSN毒株（A/WSN/1933(H1N1)）反向遗传操作系统质粒、MDCK细胞、A549细胞与DF1细胞由本实验室保存。

1.2 主要试剂 RNA提取试剂盒RNeasy Mini Kit、质粒提取试剂盒HiSpeed Plasmid Midi Kit购自QIAGEN公司；鼠源反转录酶试剂盒M-MLV、dNTP、DL2000 DNA Marker购自TaKaRa大连宝生物工程公司；Gel Extraction kit购自AXYGEN公司；高糖DMEM细胞培养基、MEM细胞培养基和低熔点琼脂糖Agarose购自Invitrogen公司；MEM粉末、胎牛血清（FBS）、转染试剂Mirus、HEPES(1M)购自Gibco公司；TPCK-trypsin、7.5%BSA购自Sigma公司；青链霉素、庆大霉素和4%多聚甲醛购自生工生物公司；琼脂糖购自BIOWEST公司；GoldView 购自赛百威公司；PCR Mix和超纯水购自东盛生物有限公司；酵母提取物Yeast Extract和蛋白胨Tryptone购自OXOID公司；NaCl购自国药集团化学试剂有限公司；感受态大肠杆菌DH5α购自北京全式金公司；小鼠IgG-免疫组化试剂盒（SABC即用型）、DAB显色试剂购自博士德生物工程有限公司；流感病毒NP蛋白3G4单克隆单抗为本实验室制备。

1.3 引物设计 根据流感病毒8个基因片段，设计A型流感病毒通用性扩增引物及流感病毒反转录通用引物l2 bp (表1)，由苏州金维智生物公司合成。

1.4 质粒鉴定与纯化 质粒按照常规方法转化到E.coli DH5α感受态细胞中，取100 µL菌液涂布于含有氨苄青霉素（50 µg/mL）LB平板上，37℃培养12 h。挑取白色孤立菌落，接种于5 mL含有氨苄青霉素（50 µg/mL）LB液体培养基，37℃恒温振荡器内培养8 h。菌液PCR鉴定阳性克隆，保存菌液并取适量菌液送金维智公司进行序列测定。序列正确的菌液进行扩增，按照HiSpeed Plasmid Midi Kit试剂盒说明书抽提质粒，并测定其浓度。

1.5 病毒拯救 拯救含有5个WSN毒株的基因、含有H9N2毒株的HA、NA表面基因以及聚合酶单基因或NP单基因的r2093HANAPB2/WSN、r2093HANAPB1/WSN、r2093HANAPA/WSN、r2093HANANP/WSN四种重组病毒，以及A2093和WSN亲本毒株。具体步骤如下：将293T细胞传代培养在直径35 mm 培养皿上。细胞状态良好且长至70%～80%时，进行转染，将250 µL不含血清的opti-MEM培养液分别加至2个无菌的1.5 mL EP管中，按照每个质粒1 µg的量与对应重组形式加入1个EP管中，混匀；将24 µL Mirus转染试剂加入另1个EP管中，混合并作用5 min后，将两溶液混匀，室温静止30 min。将37℃预热的无血清opti-MEM轻轻加至293T细胞培养皿中，清洗2次。将上述混合液滴加到293T细胞培养皿上并补加无血清opti-MEM至2 mL，37℃、5% CO2细胞培养箱培养46 h后用TPCK-trypsin处理，作用2 h后将细胞上清及细胞混合液接种到9~11日龄的SPF鸡胚（500 µL/枚），37℃孵化器继续孵化48 h后，进行血凝（hemagglutination，HA)试验。收集血凝为阳性的鸡胚尿囊液，分装，于－80℃保存。

1.6 拯救病毒的鉴定 对收取的鸡胚尿囊液用RNA提取试剂盒RNeasy Mini Kit提取病毒RNA，并反转录成cDNA。以此cDNA为模板，使用PCR mix（TaKaRa，中国）以及流感特异性扩增引物(表1)扩增拯救病毒的8基因片段。反应体系：2×PCR mix 12.5 µL、上游引物1 µL、下游引物1 µL、cDNA 2 µL、灭菌ddH2O 补至25 µL。PCR程序：94℃预变性5min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2.5 min，循环30次；72℃再延伸10 min。PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，将特异条带进行胶回收，并送金维智测序公司测序，测序结果与模板序列比对。

1.7 病毒滴度的测定 将病毒尿囊液作10倍系列稀释，取10-5、10-6稀释度接种于六孔板中生长状态良好、密度在70%~80%的MDCK细胞，每个稀释度做1个重复。感作1 h后清洗六孔板2次，用含1%的低熔点琼脂糖、无血清的细胞凝胶培养基覆盖。凝胶凝固后，将六孔板倒扣放在37℃、5%CO2细胞培养箱，继续培养96 h，进行免疫组化染色。具体步骤如下：取出六孔板滴加4%多聚甲醛固定20 min；去除胶块用4%多聚甲醛再次固定20 min；加入0.5%Triton-100，室温作用15 min；PBS清洗，5 min×3次，5%BSA封闭液37℃孵育30 min，甩干、勿洗；滴加特异性NP蛋白单克隆抗体，37℃孵育1 h；PBS清洗，5 min×3次，滴加生物素化标记山羊抗小鼠IgG，37℃孵育30 min；PBS清洗，5 min×3次，滴加SABC，37℃孵育30 min；PBS清洗，5 min×3次，DAB显色剂显色，按1 mL蒸馏水加显色剂A、B、C各1滴，混匀，加至标本上，一般显色时间为1~10 min。观察病毒蚀斑数并记录。

1.8 生长曲线的绘制 以0.001 MOI的剂量分别将病毒接种至生长状态良好、密度在70%~80%的MDCK细胞、DF1细胞和A549细胞上，每株细胞在每个细胞上做2个重复。分别于接种后12、24、48、72 h四个时间点收集病毒液300µL，采用蚀斑方法测定病毒滴度，利用GraphPad Prism 5软件绘制生长曲线。

1.9 病毒在小鼠体内复制情况的比较 将18只4~6周龄雌性BALB/c小鼠随机分为6组，每组3只，分别放置于6个SPF级小鼠隔离器中。每只小鼠滴鼻接种105PFU病毒，每株病毒感染3只小鼠。攻毒后d 4剖杀小鼠，无菌取小鼠的鼻甲、肺脏，每个组织按照1∶1（mL/g）比例加入无菌PBS（含100单位青霉素和50µg的链霉素），置于高通量组织研磨器中研磨，4℃、12 000×g离心10 min，上清液用于后续病毒含量的测定。

2 结果

2.1 拯救病毒血凝效价 成功拯救r2093HANAPB2/WSN、r2093HANAPB1/WSN、r2093HANAPA/WSN、r2093HANANP/WSN四种重组病毒，以及A2093和WSN亲本毒株，其血凝（hemagglutination，HA）效价见表2。

表2 拯救病毒的血凝效价Table 2 The HA titer of rescued viruses

2.2 病毒序列鉴定 提取拯救病毒RNA，反转录成cDNA后，以此为模板进行流感病毒8基因片段的扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳，获得相应大小的目的片段（图1）。PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS，对应片段大小分别为2341、2341、2233、1778、1565、1413、1027、890 bp。

图1 病毒8基因片段PCR电泳结果Fig.1 PCR products of 8 gene segmentsM: DNA分子量标准(DL2000); 1:PB2基因; 2:PB1基因; 3:PA基因; 4:NP基因; 5:HA基因; 6:NA基因; 7:M基因; 8:NS基因M: DNA Marker (DL2000); 1:PB2 gene; 2:PB1 gene; 3:PA gene;4:NP gene; 5:HA gene; 6:NA gene; 7:M gene; 8:NS gene

2.3 病毒滴度测定 MDCK细胞接种病毒后铺胶，37℃、5%CO2环境孵育96 h，固定后进行NP蛋白特异性显色，观察病毒蚀斑并记录蚀斑数（表3）。

表3 拯救病毒的滴度Table 3 The titers of recombinant viruses

2.4 生长曲线的绘制 6株病毒分别以0.001 MOI的剂量感染MDCK细胞、DF1细胞、A549细胞，每株病毒在每个细胞上做2个重复，于接种后12、24、48、72 h四个时间点收集上清液，采用蚀斑方法测定病毒滴度，利用GraphPad Prism5软件绘制病毒生长情况，病毒在MDCK、DF1、A549细胞上的生长曲线见图2。

由病毒生长曲线可知，6株病毒均能在MDCK细胞上高效复制，病毒滴度在24 h内可达到最大值（＞105PFU/mL），r2093HANAPB2/WSN重组病毒在3种细胞上的复制能力均最差。在A549细胞上的复制情况差异较大，r2093HANAPB2/WSN、r2093HANANP/WSN和A2093复制能力均比较差。在A549和DF1细胞上6株病毒在各个时间点的滴度都低于MDCK细胞上相应时间点的病毒滴度。

图2 病毒在MDCK、DF1、A549细胞上的生长曲线Fig. 2 Replication kinetics of recombinant viruses in MDCK,DF1 and A549 cells注: 差异分析在r2093HANAPB2/WSN与其余3种重组病毒之间分别进行。 **代表差异具有显著统计学意义(P＜0.05); ***代表差异具有极显著统计学意义(P＜0.01)Note: The variation analysis was conducted between r2093HANAPB2/WSN and the other three recombinant viruses,** standing for significant difference (P＜0.05); *** standing for extremely significant difference (P＜0.001)

2.5 病毒在小鼠体内复制情况的比较 每株病毒接种3只小鼠，通过滴鼻接种105PFU病毒，攻毒后d 4剖杀小鼠，无菌取小鼠的鼻甲、肺脏，高通量振荡器研磨后，测定病毒滴度，利用GraphPad Prism5软件绘制病毒复制柱状图（图3）。

图3 小鼠肺脏和鼻腔病毒滴定结果Fig.3 Replication of inf l uenza viruses in lungs and nasal turbinates of mice

在小鼠体内，4株重组病毒的复制能力均介于亲本毒A2093和WSN之间，在肺脏中4株重组病毒的复制能力相似，但在鼻腔中r2093HANAPB1/WSN和r2093HANAPA/WSN的复制能力明显高于r2093 HANAPB2/WSN和r2093HANANP/WSN。

3 讨论

自从1918年西班牙流感爆发以来，1957年、1968年和2009年分别再次爆发流感，但导致形成大流行流感的因素还不清楚[15,16]。4次典型流感大流行中有3次聚合酶基因发生重组的原因依然很神秘。研究显示，1957年亚洲流感H2N2亚型病毒是由禽源HA、NA、PB1基因与人H1N1亚型流感病毒重组而来，在重组过程中同时提供了HA、NA表面基因，使得流行毒株获得逃逸人体现有免疫机制的能力。1968年香港流感H3N2亚型病毒是由禽源HA、PB1基因与人H2N2亚型流感病毒重组而来[17]。可见，聚合酶重组的病毒可能会加速病毒适应宿主的进程。

很多研究表明自然界中广泛存在的H9N2亚型病毒易于与其他亚型的病毒发生重组，并且流感病毒不同基因节段在发生重组的过程中存在表面基因匹配的现象。本研究拯救含有WSN基因的H9N2亚型流感病毒株r2093HANAPB2/WSN、r2093HANAPB1/WSN、r2093HANAPA/WSN、r2093HANANP/WSN四种重组病毒。 其中，r2093HANAPB1/WSN、r2093HANAPA/WSN两种重组形式的病毒复制效率明显高于另外两种（图3）。Wendel等[8]的研究指出PB1单基因重组的病毒增加了聚合酶活性，提高了其在人源细胞上的复制能力，与本研究结果相一致。PB1或PA重组后促进病毒增长的内部机制需要进一步实验研究。重组病毒复制增加后对病毒的变异有何影响？是否可能加速病毒的变异来适应宿主环境，引起流感病毒区域流行？这些问题需要进一步的研究探讨。

r2093HANAPB2/WSN在MDCK、DF1、A549细胞系上复制效率都很低，且T检验差异具有显著统计学意义（P＜0.05），说明替换的PB2基因在病毒复制过程中同样起到关键作用。禽源H10N8、H7N9和H9N2亚型流感病毒的PB2-588V使其聚合酶活性增加，在禽类细胞系和哺乳动物细胞系上的复制效率更高，对小鼠的致病性更强[18]。有研究表明对小鼠低致病性而对禽类高致病性的SC35(H7N7)亚型流感病毒，在小鼠体内发生适应性突变SC35M后，对小鼠的致病性显著增强，且在哺乳细胞上的聚合酶活性增加，复制效率增强[19]。本研究中H9N2的PB2-588A可能是r2093HANAPB2/WSN病毒复制效率低的原因。可见，流感病毒在自然状态下可能会发生关键位点的突变，导致复制效率的提高和致病性的增强。自2013年以来，禽源H9N2亚型流感病毒的PB2-588V比例显著上升[18]。因此，此位点应给与更多的关注。

本研究成功拯救携带H9N2亚型流感病毒株的HA、NA表面基因以及聚合酶单基因或NP单基因的重组病毒，并对比研究了它们的复制能力，分析相关关键基因的分子特征。结果表明，与禽流感病毒的不同聚合酶或NP基因重组产生的新病毒，复制能力具有明显差别，造成这种差异的分子机制值得进一步研究。PB2-588V突变在H9N2亚型流感病毒中比例增加，所以在流感的防控监测领域应该给与一定的重视。