脉冲强光杀菌技术和2 种保鲜剂在清蒸鲤鱼中的应用

蒋 奕，俞龙浩*

（黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江 大庆 163319）

鲤鱼是最重要的商业淡水鱼类之一[1]，其因富含蛋白质及不饱和脂肪酸而颇受消费者喜爱，但内源性酶及微生物作用引起的脂质氧化[2]使鱼制品在贮藏过程中极易氧化变质。基于目前传统杀菌技术存在的种种不足，为了更好地延缓鲤鱼制品的质量恶化，冷杀菌技术逐渐成为研究热点。

脉冲强光杀菌技术是近年来发展起来的一种非热杀菌技术[3]，其利用瞬时、高强度的脉冲光能量对食品中各类微生物进行快速灭菌[4-6]。因操作安全、杀菌均匀[7]等优点，脉冲强光杀菌技术已被广泛应用于畜禽产品、果蔬制品及粮油制品中[8]。何余堂等[9]研究脉冲强光技术对鲜食玉米的保鲜效果，结果表明，当脉冲能量300 J、脉冲距离10 cm、闪照次数32 次时，玉米的保鲜效果最好。王勃等[10]的研究表明，当闪照距离10 cm、脉冲能量400 J时，脉冲强光对月饼表面霉菌的杀菌率可达99.85%。

随着人们健康安全意识的不断提升，双乙酸钠作为高效、无毒的杀菌防腐剂越来越受到消费者的好评。1987年，世界卫生组织和联合国粮农组织批准双乙酸钠作为防腐剂添加到食品中[11]。双乙酸钠具有性能好[12]、应用范围广、使用方便灵活（可直接加入到食品中或浸渍、喷洒）[13]及营养特殊等优点[14]，被广泛用于烘烤食品、肉制品、果蔬制品及饮料制品等加工食品中[15]。双乙酸钠对鱼类有特殊的保鲜效果，将用10%双乙酸钠水溶液浸泡过的鱼放入塑料袋内，室温（25 ℃）放置15 d仍然能够保持新鲜[16]。

乳酸双芽菌是一种新型的液态生物食品防腐剂[17]，由于其抑菌效果好、安全无副作用（在消化道内降解为食品中所含的正常成分）、使用方便（可直接加入到食品中，也可经喷雾干燥成粉后加入到食品中），目前已广泛应用于肉制品、乳制品、饮料制品、烘焙食品及发酵食品等领域[18]。王心礼[19]的研究表明，乳酸双芽菌对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果普遍优于山梨酸钾。侯靖等[20]发明的腐竹花生黄豆的专用防腐工艺专利表明，乳酸双芽菌对其熟化的腐竹、花生、黄豆中的绝大多数菌有杀灭作用，5 d后霉菌发生概率在5%以下，且保质期可达18 个月。

关于脉冲强光对食品杀菌的研究，国内外从20世纪90年代初开始就有相关报道[21]。而关于脉冲强光杀菌结合保鲜剂在清蒸鲤鱼中的应用，国内外还尚未报道。本研究的目的为优化脉冲强光杀菌结合双乙酸钠和乳酸双芽菌2 种保鲜剂应用于清蒸鲤鱼保鲜时的最佳杀菌条件，旨在为后续的鱼制品加工保鲜提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜鲤鱼购自黑龙江省大庆市北京华联超市，所有鲤鱼均在同一水产养殖场养殖，质量（1 138.5±71.0） g，长度（39.8±1.0） cm。

双乙酸钠 南通奥凯生物科技开发有限公司；乳酸双芽菌 绥化市蓝源生物工程有限公司；平板计数琼脂青岛高科技工业园海博生物科技有限公司；氯化钠 辽宁泉瑞试剂有限公司；所有试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

DK-S24电热恒温水浴锅、DGG-9030A电热恒温鼓风干燥箱、DRP-9272电热恒温培养箱 上海森信实验仪器有限公司；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂；DL-CJ-2NDI洁净工作台 北京东联哈尔仪器制造有限公司；MXA3*18EA1脉冲强光消毒柜 常州市兰诺光电科技有限公司；AR223CN电子天平 上海奥豪斯仪器有限公司；ScienTZ-04无菌均质机 宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

将鲤鱼进行敲击式击晕，随后宰杀并去腮、去鳞、去内脏，20 min内运送到实验室，用流动的自来水冲洗鲤鱼体表和体内的血液，并将鱼腹腔内的所有黑膜去除。清洗后的鲤鱼进行均匀分块，备用。

1.3.2 单因素试验设计

将鱼肉块分别浸入不同质量浓度的双乙酸钠和乳酸双芽菌中，浸泡0.5 h取出后清蒸（放入葱、姜、盐调味）；清蒸后冷却至室温，将肉块装入透明的聚乙烯包装袋中热封，随即进行脉冲强光杀菌处理。

按照不同条件对鱼肉块进行处理，放置1 d后，测定其菌落总数，分别进行单因素试验：1）不同双乙酸钠质量浓度（0.5、0.7、0.9、1.1、1.3 g/100 mL）、乳酸双芽菌质量浓度0.13 g/100 mL、脉冲能量400 J、脉冲距离10 cm；2）不同乳酸双芽菌质量浓度（0.05、0.09、0.13、0.17、0.21 g/100 mL）、双乙酸钠质量浓度0.9 g/100 mL、脉冲能量400 J、脉冲距离10 cm；3）不同脉冲能量（200、300、400、500、600 J）、双乙酸钠质量浓度0.9 g/100 mL、乳酸双芽菌质量浓度0.13 g/100 mL、脉冲距离10 cm；4）不同脉冲距离（6、8、10、12、14 cm）、双乙酸钠质量浓度0.9 g/100 mL、乳酸双芽菌质量浓度0.13 g/100 mL、脉冲能量400 J。

1.3.3 响应面试验设计

根据单因素试验结果，以脉冲能量、脉冲距离、双乙酸钠质量浓度和乳酸双芽菌质量浓度4 个因素为自变量，以鱼肉的菌落总数为响应值进行响应面试验设计。

1.3.4 菌落总数测定

参考GB/T 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[22]。称取25 g鱼肉糜，置于225 mL无菌生理盐水中，在振荡器上充分振荡混匀，制成鱼肉糜和鱼浆液比例为1∶10（m/V）的样品匀液；用1 mL无菌吸管吸取1 mL样品匀液，沿管壁缓慢注于盛有9 mL生理盐水的无菌试管中，制成1∶100（m/V）的样品匀液；依此类推，选取3 个适宜稀释度的样品匀液（包括原液），各取1 mL稀释液，于平板计数琼脂平板上进行涂布，（30±1） ℃培养（72±3） h，用平板计数法测定菌落总数。菌落总数按照下式计算。

式中：ΣC为平板菌落数之和；n1为第1稀释度（稀释100 倍）平板个数；n2为第2稀释度（稀释1 000 倍）平板个数；d为稀释因子（第1稀释度）。

1.4 数据处理

应用Design-Expert V8.0.6软件进行响应面试验设计，采用Origin 2017软件进行图表绘制。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 双乙酸钠质量浓度对清蒸鲤鱼菌落总数的影响

图1 双乙酸钠质量浓度对清蒸鲤鱼菌落总数的影响Fig. 1 Effect of sodium diacetate concentration on aerobic bacterial count of steamed carp

由图1可知，随着双乙酸钠质量浓度的增大，清蒸鲤鱼的菌落总数呈先下降后上升的趋势。当双乙酸钠质量浓度分别为0.5、0.7、0.9 g/100 mL时，其对清蒸鲤鱼菌落总数的影响显著（P＜0.05）；双乙酸钠的质量浓度继续增大为1.1、1.3 g/100 mL时，其对清蒸鲤鱼菌落总数的影响无显著差异（P＞0.05）。与未用双乙酸钠处理的清蒸鲤鱼相比，用双乙酸钠处理过的鲤鱼菌落总数降低，其抗菌作用是由于其分子内的单分子乙酸与类脂化合物能较好地相溶，因而能够较有效地透过细胞壁，渗透进入霉菌或细菌的细胞体中，干扰细胞间酶的相互作用，导致细胞内蛋白质变性，使菌体细胞脱水死亡，从而起到抑菌作用[23]。殷铭等[24]的研究表明，用20%双乙酸钠水溶液对莴苣、草莓等果蔬进行喷洒处理，果蔬表面的细菌总数取得了预期效果，与本研究的结果一致。当双乙酸钠质量浓度为1.1 g/100 mL时，清蒸鲤鱼的菌落总数最小，故选取双乙酸钠质量浓度为0.9、1.1、1.3 g/100 mL进行响应面试验。

2.1.2 乳酸双芽菌质量浓度对清蒸鲤鱼菌落总数的影响

图2 乳酸双芽菌质量浓度对清蒸鲤鱼菌落总数的影响Fig. 2 Effect of double buds Lactobacillus concentration on aerobic bacterial count of steamed carp

由图2可知，随着乳酸双芽菌质量浓度的增大，清蒸鲤鱼的菌落总数呈先下降后上升的趋势。当乳酸双芽菌质量浓度为0.21 g/100 mL时，与0.17 g/100 mL时相比，其对清蒸鲤鱼菌落总数的影响不显著（P＞0.05）。与未用乳酸双芽菌处理的清蒸鲤鱼相比，用乳酸双芽菌处理过的鲤鱼菌落总数降低，这可能是由于乳酸双芽菌建立了酶生物合成和活性调节模式，使微生物的膜通透性增加，能量系统被破坏，从而抑制微生物的生长。当乳酸双芽菌质量浓度为0.17 g/100 mL时，清蒸鲤鱼的菌落总数最小，故选取乳酸双芽菌质量浓度为0.13、0.17、0.21 g/100 mL进行响应面试验。

2.1.3 脉冲能量对清蒸鲤鱼菌落总数的影响

图3 脉冲能量对清蒸鲤鱼菌落总数的影响Fig. 3 Effect of pulsed light energy on aerobic bacterial count of steamed carp

由图3可知，随着脉冲能量的增加，清蒸鲤鱼的菌落总数呈先下降后趋于平缓的趋势。与400 J相比，当脉冲能量增加到500 J时，其对清蒸鲤鱼菌落总数的影响显著（P＜0.05）；与500 J相比，当脉冲能量增加到600 J时，其对清蒸鲤鱼菌落总数的影响不显著（P＞0.05）。脉冲能量是影响脉冲强光杀菌效果的重要因素[25]。与对照组相比，脉冲强光处理过的清蒸鲤鱼菌落总数降低，这可能是由于微生物细胞具有比周围介质更高的脉冲吸收光[26]，脉冲强光处理对细胞膜造成了极大损伤，并大幅度降低了胞内酶的活性，导致微生物死亡[27]。在保证杀菌效果的前提下，应尽可能地节约能源，当脉冲能量为500 J时，清蒸鲤鱼的菌落总数最小，故选取脉冲能量为400、500、600 J进行响应面试验。

2.1.4 脉冲距离对清蒸鲤鱼菌落总数的影响

图4 脉冲距离对清蒸鲤鱼菌落总数的影响Fig. 4 Effect of light source distance on aerobic bacterial count of steamed carp

由图4可知，随着脉冲距离的增大，清蒸鲤鱼的菌落总数呈先下降后上升的趋势。在8～14 cm范围内，脉冲灯光与样品距离越近，样品的菌落总数越小，灭菌效果也越明显[28]。Wuytack等[29]认为，脉冲强光对微生物的灭活主要是由于DNA结构的改变，适当的脉冲距离会增强杀菌效果。王勃等[30]的研究表明，当脉冲距离为12.8 cm时，可使巴氏乳的霉菌灭菌率达99.97%，这显示出脉冲距离对杀菌效果的积极影响。在本研究中，当脉冲距离为8 cm时，清蒸鲤鱼的菌落总数最小，故选取脉冲距离为6、8、10 cm进行响应面试验。

2.2 响应面试验结果

2.2.1 Box-Behnken响应面优化试验及结果

采用Box-Behnken进行响应面优化试验，一共包括29 个试验点，其中包括24 个析因点（1～24）以及5 个零点（25～29）。各因素水平及编码如表1所示，Box-Behnken响应面试验结果如表2所示。

表 1 响应面因素水平与编码Table 1 Code and level of independent variables used in Box-Behnken design

表 2 Box-Behnken响应面试验结果Table 2 Box-Behnken design with response variable

对表2中的数据进行多元回归拟合，得到脉冲能量、脉冲距离、双乙酸钠质量浓度和乳酸双芽菌质量浓度与菌落总数的二次回归方程模型：Y=2.54+0.14A－0.54B－0.48C－0.11D+0.15AB+0.05AC+0.02AD+0.18BC+0.17BD+0.01CD+0.78A2+0.53B2+0.65C2+0.50D2。

表 3 回归方程系数的显著性检验Table 3 Significance test of regression model

由表3可知，所设计的模型成立，因为模型极显著（P＜0.01），失拟项P=0.386 6＞0.05，不显著。所得到的回归方程的R2=0.981 0，=0.962 0，说明该回归方程对试验结果的拟合效果很好，试验误差小。因此，可用此模型分析和预测经双乙酸钠和乳酸双芽菌及脉冲强光杀菌处理后清蒸鲤鱼的菌落总数。

模型一次项A、B、C、D，交互项AB、BC、BD，二次项A2、B2、C2、D2对清蒸鲤鱼菌落总数的影响显著（P＜0.05），交互项AC、AD、CD对清蒸鲤鱼菌落总数的影响不显著（P＞0.05）。4 个因素对清蒸鲤鱼菌落总数的影响大小顺序为B＞C＞A＞D，即脉冲距离＞双乙酸钠质量浓度＞脉冲能量＞乳酸双芽菌质量浓度。

2.2.2 两因子间的交互作用分析

图5为当双乙酸钠质量浓度为1.1 g/100 mL、乳酸双芽菌质量浓度为0.17 g/100 mL时，脉冲能量和脉冲距离的交互作用响应面分析图。由等高线图可以看出，清蒸鲤鱼的菌落总数随着脉冲能量的增加先减小后增大，且清蒸鲤鱼的菌落总数也随脉冲距离的增大先减小后增大，并且等高线图呈椭圆形，说明脉冲能量与脉冲距离的交互效果较好[31]。从3D响应面图也可以看出，响应曲面的坡度较陡，也说明脉冲能量和脉冲距离的交互效果显著。

图5 脉冲能量和脉冲距离的交互作用响应面分析图Fig. 5 Response surface plot showing the interaction between pulse energy and pulse distance

图6 脉冲距离和双乙酸钠质量浓度的交互作用响应面分析图Fig. 6 Response surface plot showing the interaction between pulse distance and sodium diacetate concentration

图6为当乳酸双芽菌质量浓度为0.17 g/100 mL、脉冲能量为500 J时，脉冲距离和双乙酸钠质量浓度的交互作用响应面分析图。从3D响应面图可以看出，清蒸鲤鱼的菌落总数随着脉冲距离的增加先减小后增大，随双乙酸钠质量浓度的增大先减小后增大，并且响应曲面的坡度较陡，说明脉冲距离与双乙酸钠质量浓度的交互效果较好。等高线图呈椭圆形且较密集，也说明脉冲距离和双乙酸钠质量浓度的交互效果显著。

图7 脉冲距离和乳酸双芽菌质量浓度的交互作用响应面分析图Fig. 7 Response surface plot showing the interaction between pulse distance and double buds Lactobacillus concentration

图7为当双乙酸钠质量浓度为1.1 g/100 mL、脉冲能量500 J时，脉冲距离和乳酸双芽菌质量浓度的交互作用响应面分析图。由等高线图可以看出，清蒸鲤鱼的菌落总数随着脉冲距离的增加先减小后增大，也随乳酸双芽菌质量浓度的增大先减小后增大，并且等高线图呈椭圆形且密集，说明脉冲距离与乳酸双芽菌质量浓度的交互效果较好。响应曲面的坡度较陡，也说明脉冲距离和乳酸双芽菌质量浓度的交互效果显著。

2.2.3 最优组合的确定及验证

Design Expert V8.0.6软件预测出的最优实验条件为脉冲能量482.61 J、脉冲距离8.72 cm、双乙酸钠质量浓度1.15 g/100 mL、乳酸双芽菌质量浓度0.17 g/100 mL，在此条件下预测清蒸鲤鱼的菌落总数为2.34（lg（CFU/g））。结合实际操作的可行性，将最优实验条件更改为脉冲能量480 J、脉冲距离9 cm、双乙酸钠质量浓度1.1 g/100 mL、乳酸双芽菌质量浓度0.17 g/100 mL，在此条件下进行验证实验，得到清蒸鲤鱼的菌落总数为2.36（lg（CFU/g）），证明了该模型的可行性和有效性。

3 结 论

本研究探究了双乙酸钠质量浓度、乳酸双芽菌质量浓度、脉冲能量和脉冲距离4 个因素对清蒸鲤鱼灭菌效果的影响。在单因素试验基础上，通过响应面分析优化，建立了回归方程模型，得到最佳处理条件为脉冲能量480 J、脉冲距离9 cm、双乙酸钠质量浓度1.1 g/100 mL、乳酸双芽菌质量浓度0.17 g/100 mL。结果表明，脉冲强光结合双乙酸钠及乳酸双芽菌等保鲜剂处理可有效降低清蒸鲤鱼的菌落总数，是一种有效的鱼制品保鲜技术。