光学相干层析成像技术在耳科学研究中的应用

张玉梅 杨琳 戴培东 张腾艺

1991年，美国麻省理工学院的Huang等[1]首次提出了光学相干层析成像技术(optical coherence tomography，OCT)，并应用OCT完成了视盘的离体成像；1995年，奥地利维也纳大学的Fetcher等[2]提出了基于频谱干涉测量法的谱域OCT；1997 年，美国麻省理工学院的Chinn等[3]报道了基于扫频光源的OCT。近年来，OCT经过不断改进，开发了新的光束传输通道和探头，在生物医学领域具有较大的应用潜力。目前，OCT不仅能快速实时成像，获得微米(μm)级的高分辨率图像，还可以对活体表面下深2～3 mm的组织微观结构进行三维成像，具有较大的层析能力；此外，OCT还可以与一些功能性检查技术结合，如和多普勒测振技术相结合，可实现纳米(nm)级的振动测量。我国OCT在医学中的应用研究起步较晚，在耳科学的应用研究鲜有报道。

1 OCT的技术原理

OCT是一种基于光学干涉原理的新型成像仪器，其测量的是入射光在材料或组织内部不同深度的散射和反射光强度，主要包含5个模块：入射光源、参考光路、测量光路、探测器和数据处理。OCT分为时域OCT(time domain OCT，TD-OCT)和傅里叶域OCT(Fourier domain OTC，FD-OCT)，其中，TD-OCT出现较早，是第1～3代OCT的工作方式。TD-OCT是基于宽带光源(SLD，超亮发光二极管)照明的迈克尔逊干涉仪，利用分光器将入射光分为参考光和测量光，被检样品的后向散射光和参考光路反射回来的参考光产生干涉，干涉信号输出到光电探测器[电荷耦合器件(charge-coupled device, CCD)]，CCD将光信号转换成电信号，并经过信号采集、放大、滤波等数据处理，最后由计算机合成图像。干涉信号强度对应样品的反射强度，通过轴向移动参考镜，得到样品不同深度的反射率分布图像，再通过样品表面的横向扫描，即可得到二维图像，其结构示意图如图1所示。

图1. TD-OCT的结构示意图 a. 宽带SLD光源；b. 分光器；c. 组织；d. 参考镜；e. 光电探测器；f. 数据采集系统；g. 计算机

根据获得光谱的方法不同，FD-OCT又分为扫频源OCT(swept-source OCT，SS-OCT)和光谱OCT(spectral domain OCT，SD-OCT)。SS-OCT是基于扫频光源，通过在宽带光源后连接一个波长随时间高速扫描的单色仪，再通过探测器记录每一波长的信号进而得到干涉光谱，其参考光路中的参考镜是固定的，在探测模块中采用分光谱技术通过对干涉光谱进行快速傅立叶逆变换得到深度信息，从而将样品不同深度的干涉信号进行一次性测量，相当于在时间上分频谱；SD-OCT是基于光栅和透镜的干涉成像光谱仪，光栅将干涉信号按照不同波长进行分光，再聚焦到线阵CCD同时测量，相当于在空间上分频谱。与TD-OCT相比，尽管多了光谱探测装置和额外的信号处理步骤，由于不需要移动参考镜，逐点的深入扫描，先后探测样品的各个深度信息，FD-OCT在成像速度和灵敏度上有了显著的提高。与CT、MR、超声等其他成像技术比较，OCT提供了前所未有的高分辨率图像，其轴向(深度)分辨率达到10 μm，横向分辨率达20 μm，可以进行病理组织学水平的成像和测量。OCT的轴向分辨率与中心波长成正比，与光源带宽成反比，横向分辨率与聚焦物镜相关。

2 OCT在中内耳的成像

2.1 TD-OCT的成像 2000年，美国加州大学的Zhao等[4]首次采用中心波长为856 nm、带宽为25 nm的TD-OCT对固定大鼠颞骨的内耳部分进行成像。该系统轴向分辨率为10～15 μm，成像速度为5～15 min，耳蜗内的某些结构，如前庭膜、基底膜等可清晰成像，但精细的显微解剖结构，如毛细胞、Corti器和血管等无法成像，原因是缺少足够的信号强度和分辨率。实验还发现，采用其他光源(中心波长为1 310 nm)的TD-OCT系统无法对显微解剖结构成像。2001年，Pitris等[5]采用TD-OCT对人的离体颞骨，从鼓膜外对中耳腔进行成像，中耳的重要结构均可成像，包括鼓膜、锤骨、砧骨和鼓膜张肌肌腱等。实验发现，鼓膜的存在降低了图像质量，并且听小骨的高散射性导致无法观察到其后面的组织。上述研究表明,TD-OCT对更精细的中内耳显微结构的显示具有局限性。2002年，Heermann等[6]将TD-OCT和手术显微镜相结合，确定中耳重建手术中使用的听骨链假体长度，并认为这是听力恢复的关键。2009年，Just等[7-9]在耳科手术中先后利用TD-OCT对不同组织进行成像，例如卵圆窗壁和镫骨足板。他们发现和正常患者相比，耳硬化症和鼓室硬化症患者的镫骨足板存在不均匀和增厚现象。2010年，Djalilian等[10]采用手持TD-OCT对中耳胆脂瘤患者的胆脂瘤进行成像，并将患者中耳黏膜的OCT图像与传统组织学图像进行对比，发现OCT图像中高信号区域对应于组织学图像中有炎症的中耳黏膜部分。

2.2 FD-OCT的成像 2004年，Wong等[11]采用SS-OCT分别从内、外2个方向对死后2～4 h大鼠的离体耳蜗进行了快速成像，获得了具有代表性的前庭阶、蜗管、鼓阶、耳蜗轴和螺旋韧带等结构的OCT图像。2007年，Pau等[12]采用与手术显微镜结合的SD-OCT对人的离体颞骨进行了成像研究。这个颞骨经过手术处理保持了内耳完整，实验获得了局部暴露却依旧完整的耳蜗内部组织，如鼓阶和前庭阶。该系统扫描时可实时观察图像，与B超相比，可实现非接触成像。研究表明OCT具有用于引导耳蜗植入手术的潜力。2011年，Gao等[13]发现MRI和CT的分辨率不能满足某些耳蜗软组织形态的研究(MRI和CT成像分辨率分别为1 mm和0.5 mm，耳蜗尺寸约为1 cm，软组织为10～100 μm)。他们采用SD-OCT进行了与听力有关的耳蜗软组织形态测量，实验模型为自然生长的小鼠和存在听力损伤并植入人工耳蜗的转基因小鼠。研究发现SD-OCT可以检测耳蜗发育过程中Corti器解剖结构的细微变化，通过和石蜡切片对比，发现SD-OCT可以获得常规组织学难以获得的结构信息，如不同基因型引起听力损失所对应的软组织变化。2012～2016年，报道了一系列FD-OCT在中耳炎症疾病诊断中的应用，如Nguyen等[14]设计了一种手持OCT，可用于检测中耳炎相关的细菌生物膜；Monroy等[15]发现OCT可以测量慢性和急性中耳炎中鼓膜和细菌生物膜的显著差异；Hubler等[16]和Pande等[17]先后提出了不同的算法计算上述差异值的具体大小。

2.3 OCT的3D活体成像 2010年，Subhash等[18]采用SD-OCT对大鼠耳蜗进行3D活体成像。该系统采用近红外宽带光源，高速 InGaAs相机，通过在测量光路中引入X-Y方向2个相互垂直的扫描振镜，获得X、Y平面的扫描图像，结合深度信息，使用计算机进行数据重构，从而得到大鼠耳蜗的3D图像。该系统具有较高的成像速度和分辨率，约0.45 s就可复原得到整个耳蜗的3D图像，图像大小为 512像素×128像素。该研究表明SD-OCT可应用于大鼠耳蜗结构的3D活体成像，例如听软骨囊、前庭膜、基底膜、耳蜗盖膜、Corti器、蜗轴顶部和第2转等。2017年，Park等[19]研制了一种适合人体鼓膜3D活体成像的宽场SD-OCT探头，其核心部件是测量光路中加入的中继透镜。该部件可保证横向扫描范围达7 mm，是原先的3.5倍，且采用对角线扫描的方式，减少了原先手持探头扫描时运动产生的伪影。与光栅扫描相比，该系统仅通过扫描对角线即可构造3D图像，所需的二维图像减少了一半。通过250～500个样本量的扫描，证明该系统构造同质量3D图像的时间比原先缩短了一半。该研究小组还应用上述OCT在人和动物进行了鼓膜活体实时成像实验，发现每幅3D图像均可在10 ms内获得，图像大小为1 024像素×500像素。

3 与听力有关的振动测量

多普勒OCT[20]是重要的功能成像模式之一，它将OCT与多普勒技术有机结合，可以在对被测样品内部结构进行成像的同时，根据探测到的多普勒频移来获得样品内散射粒子的流速/振动信息，具有较高的临床应用价值。在振动测量方面，多普勒OCT和激光多普勒测振仪(laser Doppler vibration，LDV)的功能类似，可实现高分辨率、非接触和局部测量。二者的主要区别是，LDV采用的是激光光源，而OCT采用宽带光源，后者相当于加了深度门控，因此一幅多普勒OCT图像可获取不同深度的位移信息，这是LDV无法实现的。2006年，Hong等[21]使用多普勒光学干涉显微镜(Doppler optical coherence microscope，DOCM)测量了哺乳动物离体耳蜗结构中微米级组织的纳米级振动，验证了DOCM在与听力相关振动测试中的可行性。他们的方法是采用2个声光调制器产生500 kHz的稳定差频，对干涉信号的相位进行解析，从而得到位移信息，其本质是具有外差检测功能的SS-OCT。实验结果表明，DOCM可用于哺乳动物耳蜗的体外培养研究，包括基底膜、网状板、耳蜗盖膜、外毛细胞。实验中相位噪声不仅受系统信噪比影响，还来源于其他途径，例如不同光路引入的机械振动，或者环境随机噪声，可通过采用固定的机械设计，隔音和共光路干涉来降低。由于SS-OCT采用扫频技术，其采集的相位数据无法与波长信号同步，故机械抖动以及环境噪声无法排除，因而一些研究人员更倾向于采用SD-OCT进行振动测量。目前最新的偏振敏感OCT(phase-sensitive OCT，PS-OCT)能够将光信号极化，产生对比度更高的影像。2010年，Wang等[22]提出了一种PS-OCT，用来测量细胞器在Corti器内纳米级的振动，提高了<1 nm位移的微小振动测量灵敏度，且将能检测的振动位移精确到0.5 mm。2012年，Subhash等[23]尝试应用OCT对听骨链的振动进行了研究。2013年，Chang等[24]对栗鼠整个中耳腔的振动进行了3D测量。近年来，该技术在临床应用方面也有诸多研究，如2015年，Burkhardt 等[25]用OCT测量了模拟患有咽鼓管炎人耳鼓膜的振动，还测量了模拟患有中耳炎，存在中耳积液的人耳鼓膜振动[26]。2016年，Park等[27]和Dan等[28]分别设计了合适的成像探头，对一系列患者进行了类似测量。

4 结语

一般而言，对于中耳成像，技术关键不在于OCT本身，而在于选用合适的成像探头，大部分公司将OCT与耳镜相结合设计成手持式探头或安装手术显微镜头等。对于内耳成像，OCT的缺点是只能观察较浅层的组织结构，对于较深层的组织，需要打开耳蜗壁进行成像，因而必须精确定位和钻孔，确保基底膜的完整。Fujita等[29]曾设想采用小的探头通过圆窗实现。为了研究内耳的某些微观结构，如毛细胞，OCT的系统分辨率有待进一步提高，而OCT的轴向分辨率主要取决于光源的相干长度，相干长度越小，分辨率越高，受光源频谱范围的限制，轴向分辨率不可能无限提高；OCT的横向分辨率和普通光学显微镜一样，取决于物镜的数值孔径(numerical aperture， NA)，NA越大，横向分辨率越高，然而当NA变大时，成像的深度范围会缩小。实际设计时需综合考虑分辨率和成像范围，选择合适的物镜。多普勒OCT中，采用相位分辨方法计算相邻行扫描之间的相位变化来提取测量值，但相位分辨法在低信噪比环境下存在较大的偏差，并且对环境的扰动非常敏感，为此学者们发展了一些改进算法，但仍具有局限性；另外，它只能测振动方向与光传播方向平行的相对位移，无法得到绝对位移，其他方向的相对位移必须知道振动方向和光路的夹角，或者采用多光路检测。总之，OCT的发展趋势是向高成像速度、高成像分辨率、高探测深度、小体积和低成本方向发展。