银杏叶中黄酮类化合物提取方法研究

崔润丽， 李 楠

(河北化工医药职业技术学院，河北 石家庄 050031)

引 言

银杏叶中含有多种活性物质，包括黄酮类、氨基酸和维生素等[1-3]，其提取物可用于治疗心血管疾病、老年痴呆、皮肤病、哮喘、癌症等疾病[4-6]，其中，黄酮类化合物表现出较好的生理活性，在治疗高血压、冠心病、癌症等方面疗效显著，且提取物无毒副作用。银杏叶是可再生资源，从中提取黄酮类化合物具有明显优势[7]。

水作溶剂虽溶剂无残留，但因收率低，杂质高，易霉变，后处理困难等原因，效果不佳，本研究以乙醇作为提取溶剂，可以改善上述情况[7-10]。微波使物质由内而外进行加热，可以有效防止表面阻力的形成，促进有效成分顺利溶入提取剂[11-15]。超声波具有很强的穿透性，促进溶剂进入组织内部，显著提高有效成分溶出[16-20]。本研究首先进行单因素实验，确定各因素影响范围，再进行正交实验，确立每种提取方法最佳工艺，测定平均提取率，确定最佳提取方法和提取条件。

1 黄酮类含量测定

1.1 芦丁标准曲线制作

准确配置0.052 mg/mL芦丁标准液，分别吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL标准液置10 mL具塞试管中，蒸馏水为对照，用30%乙醇定容至5 mL。加入5.0 g/L亚硝酸钠溶液0.3 mL，旋涡振荡混匀，静置6 min。加0.3 mL 100 g/L硝酸铝溶液，迅速振荡，静置6 min。加入4 mL 0.1 mol/L氢氧化钠溶液，用蒸馏水定容到100.0 mL，混匀。静置15 min，在510 nm波长处测定吸光度。

吸光度为横坐标，芦丁含量为纵坐标，绘制标准曲线，如图1。

图1 芦丁标准曲线图

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理

洗净的银杏叶于60 ℃恒温干燥至恒重，粉碎后放入干燥器中备用。

1.2.2 黄酮类化合物提取

取4.0 g银杏叶粉末于锥形瓶，加不同体积和浓度的乙醇，采用不同方法提取,超声波辅助提取不同时间。本研究均将提取物定容到25 mL，用于测定吸光度。

1.2.3 黄酮含量测定

取银杏叶粉4.0 g，70%乙醇抽提至无色，抽滤，定容。按1.1方法测定吸光度，总黄酮含量为5.74%。

1.2.4 总黄酮提取率的计算

提取液用70%乙醇定容至50 mL，按1.1方法测定吸光度，按式(1)计算提取率。

(1)

2 不同方法提取总黄酮

2.1 索氏提取法

将银杏叶粉末4.0 g，放入垫有脱脂棉的滤纸筒，将滤纸筒放入索氏提取器，按不同条件加入乙醇，不同温度下提取5 h，抽滤，定容至25 mL作为待测液。

2.1.1 单因素实验

采用乙醇索氏提取法提取黄酮的文献很多，从中选取合适的提取温度、液固比(v/w)、乙醇体积分数进行正交实验获得最佳提取条件。

2.1.2 正交实验

实验设计采用L9(34)正交表。以乙醇含量、温度、液固比 (v/w)作为影响因素，进行正交实验，结果如表1。

表1 L9(34)正交实验结果

乙醇体积分数、液固比、实验温度的极差分别为14.9、8.4和5.5，因此，乙醇含量对提取率的影响最大。最佳提取条件为A3B2C2。

2.1.3 最佳提取条件

按照A3B2C2即乙醇体积分数60%，提取温度70 ℃，液固比15∶1条件进行3次平行实验，提取率分别为82.1%、82.8%、82.6%，平均提取率为82.5%。

2.2 微波辅助提取法

将银杏叶粉末4.0 g，置消解罐中，按照实验设计加入乙醇，控制一定温度，在不同微波功率下提取一定时间，抽滤，定容到25 mL作为待测液。

2.2.1 单因素实验

2.2.1.1 微波功率的影响

在液固比为15∶1，实验温度30 ℃，乙醇体积分数70%条件下，提取6 min，进行功率影响实验，结果如图2。

图2 微波功率影响图

图2显示，微波功率在200 W～300 W，提取率随着功率增加而增加， 高于300 W后，提取率明显下降，最佳功率在300 W左右。

2.2.1.2 液固比的影响

在微波功率为300 W，温度30 ℃，乙醇体积分数70%条件下，提取6 min，进行液固比对提取率影响实验，结果如图3。

图3 液固比影响图

图3显示，液固比小于15∶1时提取率明显提高，当液固比进一步增大，提取率提高缓慢，溶剂消耗量显著增加，综合考虑，液固比为15∶1为最佳。

2.2.1.3 提取时间的影响

在微波功率300 W，温度30 ℃，乙醇含量70%，液固比15∶1条件下，进行时间对提取率影响实验，结果如图4。

图4 提取时间影响图

由图4可知，随着微波时间增加提取率迅速增加，但当超过8 min后，提取率增加缓慢，时间延长，能耗增加，综合考虑，提取时间8 min为最佳。

2.2.1.4 乙醇体积分数的影响

在微波功率300 W，温度30 ℃，液固比15∶1，微波8 min条件下，进行乙醇含量对提取率影响实验，结果如图5所示。

图5 乙醇含量影响图

由图5可知，乙醇体积分数小于70%时，提取率随着浓度增加而提高，超过70%时提取率下降。主要原因是，高浓度乙醇脱水作用增加。

2.2.2 正交实验

实验设计采用L9(34)正交表。以微波功率、液固比(v/w)、提取时间、乙醇体积分数为影响因素，进行正交实验,结果如表2。

表2 L9(34)正交实验结果

液固比、 微波功率、乙醇体积分数、提取时间的极差分别为7.4、6.4、5.4和4.3，液固比是最大影响因素。最佳提取条件为A2B3C3D2。

2.2.3 最佳提取条件实验

按照A2B3C3D2，即微波功率300 W，液固比15∶1，提取时间10 min，乙醇体积分数60%条件下进行3次平行实验，提取率为85.3%、85.6%、85.4%，平均提取率为85.4%。

2.3 超声波辅助提取法

取银杏叶粉末4.0 g，放入烧杯中，温度30 ℃条件下，进行乙醇浓度、微波功率、提取时间单因素实验，提取物抽滤，定容到25 mL作为待测液。

2.3.1 单因素实验

2.3.1.1 超声波功率的影响

在液固比15∶1，温度30 ℃，乙醇体积分数70%，提取10 min条件下，进行功率对提取率影响实验，结果如图6。

图6 超声波功率影响图

由图6可知，超声波功率240 W～280 W提取率增加显著，超过280 W～320 W下降明显，超声波功率应控制在280 W左右。

2.3.1.2 液固比的影响

在超声功率280 W，温度30 ℃，乙醇体积分数70%，提取10 min条件下，进行液固比对提取率影响实验，结果如图7。

图7 液固比影响图

提取率随着液固比增加显著，但当液固比大于15∶1以后，提取率下降迅速，主要是由于，超声破坏黄酮类结构所致，液固比为15∶1为最佳。

2.3.1.3 提取时间的影响

在超声功率280 W，温度30 ℃，乙醇体积分数70%，液固比15∶1条件下，进行提取时间对提取率影响实验，结果如图8。

图8 提取时间影响图

随着超声波时间增加提取率逐渐增加，但10 min以后，提取率明显下降，提取时间应控制在10 min左右。

2.3.1.4 乙醇体积分数的影响

在超声功率280 W，温度30 ℃，液固比15∶1，提取10 min条件下，进行乙醇含量对提取率影响实验，结果如图9。

图9 乙醇含量影响图

乙醇体积分数为70%时提取率最大，当浓度进一步增加提取率反而下降，可能与高浓度乙醇脱水作用增加有关，因此，乙醇含量70%最佳。

2.3.2 正交实验

实验设计采用L9(34)正交表。以超声波功率、液固比(v/w)、提取时间、乙醇含量作为影响因素，进行3水平正交实验,结果如表3。

表3 L9(34)正交实验结果

液固比、乙醇体积分数、提取时间、超声功率的极差分别为26.1、7.2、7.0、5.8，提取率影响最大的是液固比。最佳提取条件为A3B1C2D2。

2.3.3 最佳提取条件实验

按照A3B1C2D2即超声波功率320 W，提取10 min，乙醇体积分数70%，液固比15∶1， 30 ℃条件下进行3次平行实验，总黄酮提取率分别为91.3%、91.6%、91.7%，平均提取率为91.5%。

3 结论

本研究通过提取时间、乙醇浓度、提取温度等单因素实验和正交实验确定的最佳条件为索氏提取法：温度70 ℃，乙醇体积分数60%，液固比15∶1，提取率为82.5%；微波辅助提取法:微波功率380 W，乙醇含量60%，液固比15∶1，提取10 min，提取率为85.4%；超声波辅助提取法:超声波功率320 W，乙醇体积分数70%，温度30 ℃，液固比15∶1，提取10 min，提取率为91.5%。

以上结果显示:超声波法具有明显优势，该方法10 min提取率比乙醇浸提5 h的提取率高9%，比微波提取法高6.1%，因此，从环保、省时和节能等多方面分析，超声辅助提取是较理想的提取方法。