益肾安宫方对复发性自然流产患者外周血Th17/Treg细胞及相关细胞因子表达水平的影响*

张 伟 王晨晔 丁彩飞 孙 忻

浙江省杭州市红十字会医院 浙江 杭州 310003

复发性自然流产(RSA)病因复杂，近年来的研究表明，免疫因素，特别是与免疫调节相关的细胞因子以及调节细胞在RSA的发病机制中起到重要的作用[1-2]。本科以益肾安宫方治疗RSA患者，取效满意，观察其对RSA患者外周血Th17/Tr eg细胞、白介素-6（IL-6）、白介素-17（IL-17）、转化生长因子-β1（TGF-β1）表达水平的影响，从细胞及分子水平初步阐明作用机制。报告如下。

1 资料与方法

1.1 病例选择：分述如下。

1.1.1 RSA病例组：选择2016年7月至2017年12月于杭州市红十字会医院生殖医学科就诊的RSA患者60例（妊娠12周内，有RSA病史），签署知情同意书后，随机将其分为治疗组与对照组，每组30例。治疗组平均年龄31.60±5.06岁，平均自然流产次数2.40±0.67次；对照组平均年龄31.83±5.56岁，平均自然流产次数2.47±0.68次。

1.1.2 正常组：选择同期于本院就诊的正常早孕期女性30例（妊娠12周内，无自然流产病史）。平均年龄29.87±3.93岁。

1.2 诊断标准：西医诊断标准参照《妇产科学》（全国高等医药院校教材第7版）的相关内容制定。中医诊断标准参考《中华人民共和国国家标准·中医临床诊疗术语证候部分》《中药新药临床研究指导原则》(2002年版)及《中医妇科学》（新世纪全国高等中医药院校规划教材第2版）的相关内容制订。

1.3 治疗方案：对照组结合患者血孕酮水平给予黄体酮针20～40mg，1日1次，肌肉注射保胎治疗。治疗组在此基础上配合中医辨证施治，分为肾虚血热型和脾肾两虚型，前者给予益肾安宫Ⅰ号方（保阴煎加减：生地、熟地、炒白芍、山药、炒川断、黄芩、桑寄生各15g，阿胶珠、旱莲草各12g，甘草5g）；后者给予益肾安宫Ⅱ号方［寿胎丸合四君子汤加减：炒党参、炒川断、桑寄生、杜仲、炒白芍、熟地各15g，菟丝子30g，炒白术、茯苓、阿胶珠（烊兑）各12g，甘草5g］。每日1剂。水煎服，早晚分服。7天为1个疗程。连续服用至孕12周。

1.4 标本采集：RSA治疗组及对照组分别于治疗前、治疗后（孕12周时）抽取静脉血，正常组于首次就诊时抽取。所有研究对象均于清晨采集空腹静脉血5ml，其中3ml全血加入肝素钠抗凝管，应用Ficol l淋巴细胞分离液分离外周血单个核淋巴细胞(PBMC)；另2ml全血不抗凝，在小试管中自然凝血后收集血清，-70℃保存待用。

1.5 检测方法：采用流式细胞仪测定各样本中Th17和Tr eg细胞比例，具体操作方法按照试剂盒说明规范进行；并严格按照ELISA试剂盒说明书进行规范操作，测定IL-6、IL-17、TGF-β1血清样本的吸光度值，绘制标准曲线，计算其浓度值。

1.6 临床疗效评定标准：参照第7版《妇产科学》及《中药新药临床研究指导原则》(2002年版)的相关内容修改制定：①治愈：妊娠超过2O周，孕20周时B超检查示胎儿发育正常，与孕周相符，伴随的临床症状和体征消失或明显改善；②好转：妊娠超过以往流产最长孕周，但未超过20周，于以往流产孕周进行B超检查示胚胎(胎儿)发育正常，与孕周相符，伴随的临床症状和体征有所改善；③未愈：妊娠未超过以往流产最长孕周即发生流产，伴随的临床症状和体征无改善或有加重。B超检查示子宫大小与孕周基本相符或小于孕周，胚胎发育不良或停止发育。

2 结果

2.1 两组临床疗效比较：见表1。

表1 两组临床疗效比较

2.2 各组外周血Th17细胞与Tr eg细胞百分率、Th17/Tr eg比值比较：见表2。

表2 各组外周血Th17细胞与Tr eg细胞百分率、Th17/Tr eg比值比较（）

表2 各组外周血Th17细胞与Tr eg细胞百分率、Th17/Tr eg比值比较（）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与对照组治疗后比较，#P＜0.05；与本组治疗前比较，△P＜0.05。

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2.3 各组外周血细胞因子水平比较：见表3。

表3 各组外周血IL-6、IL-17及TGF-β1水平比较（）

表3 各组外周血IL-6、IL-17及TGF-β1水平比较（）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与对照组治疗后比较，#P＜0.05；与本组治疗前比较，△P＜0.05。

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3 讨论

复发性自然流产属中医学“滑胎”范畴，亦称“数堕胎”“屡孕屡堕”等。滑胎病机主要为母体冲任损伤，胎元不健。胎儿居于母体，全赖母体肾以系之，气以载之，血以养之，冲任以固之。若母体肾气健壮，气血充实，冲任通盛，则胎固母安；反之则滑胎。胎元不健，多由父母先天之精气亏虚，两精虽能结合，然先天禀赋不足，致使胚胎损伤或不能成形，或成形易损，故而屡孕屡堕。病性以虚为主，或为虚实夹杂之证。对滑胎者，治疗当“预培其损”，孕前宜以补肾健脾，益气养血，调理冲任为主；孕后即应积极进行保胎治疗。益肾安宫Ⅰ号方及益肾安宫Ⅱ号方分别化裁自中医经典名方保阴煎、寿胎丸合四君子汤。前者方中炒川断、寄生补肾固冲，熟地黄、阿胶珠补血养阴，黄芩清热安胎，生地清热凉血，旱莲草滋补肝肾，山药健脾养胃，白芍养血敛阴，甘草调和诸药，全方共奏益肾养阴、清热凉血、固冲安胎之功。后者方中杜仲、炒川断、寄生、菟丝子补肾益精，炒党参、炒白术、茯苓健脾益气，熟地、阿胶珠补血养阴，炒白芍养血敛阴，甘草调和诸药，全方共奏补肾健脾、益气养血、固冲安胎之效。

近年来随着免疫学领域的迅速拓展，发现RSA的发生与免疫因素密切相关。研究发现，Th17/Treg细胞在妊娠过程中发挥着不可忽视的作用，并且可以解释更多关于妊娠失败的病理机制。本研究结果表明：RSA治疗组与RSA对照组外周血中Th17细胞比例均高于正常组，而两组Tr eg细胞比例均低于正常组，两组Th17/Tr eg比值均高于正常组，提示RSA患者外周血中Th17细胞比例高于健康孕妇，Tr eg细胞比例低于健康孕妇，存在Th17/Tr eg平衡失调。Th17细胞产生的最重要的效应因子是IL-17，IL-17可与靶细胞表面IL-17受体（IL-17R）结合，具有动员和富集中性粒细胞及促炎作用，可有效介导病变组织的炎性反应[3]。IL-6和TGF-β1是Th细胞分化的关键调节因子，与Th17细胞和Tr eg细胞的分化密切相关。本研究结果表明，RSA治疗组与RSA对照组外周血IL-6、IL-17水平均高于正常组，而TGF-β1水平均低于正常组，提示RSA患者外周血IL-6、IL-17水平高于健康孕妇，而TGF-β1水平却低于健康孕妇。联合使用益肾安宫方治疗后，RSA患者外周血中Th17细胞比例下降至接近健康孕妇水平，Tr eg细胞比例上升至接近健康孕妇水平，RSA患者外周血Th17/Treg比值下降，Th17/Tr eg失衡现象得以改善，Th17/Tr eg平衡向Treg方向偏倚，有利于妊娠的维持。RSA患者外周血IL-6、IL-17水平下降至接近健康孕妇水平，TGF-β1水平上升至接近健康孕妇水平，推测益肾安宫方通过降低RSA患者外周血IL-6、IL-17水平，升高其TGF-β1水平，促使部分初始CD4+T细胞不断分化成Tr eg细胞，抑制Th17细胞的产生，使Th17/Tr eg比值维持在正常妊娠状态，最终有利于妊娠的结局。