北京地区孕晚期妇女定植B族链球菌耐药状况与血清型分布情况分析

李 东 张树琛 时琰丽 李雪清 鲁炳怀

(民航总医院检验科， 北京 100123)

无乳链球菌，又称为B族链球菌(group BStreptococcus，GBS)，可定植于孕产妇的下消化道与泌尿生殖道，其携带率与种族、地区与个体因素(如年龄、孕产次)有关[1]，国外文献[2]显示的定植率为10%～30%。自20世纪70年代以来，GBS感染后引起新生儿异常受到广泛的重视。GBS定植后，可通过宫颈口上行，侵入后致宫内感染，是围产期新生儿重要的致病菌。即使患者没有宫内感染，经阴道分娩的新生儿，如母体生殖道或直肠携带GBS，分娩过程中50%新生儿可携带该菌，可引起新生儿脑膜炎、败血症、新生儿肺炎等疾病。美国疾控中心(Centers for Disease Control，CDC)[2]于2010年推出的《围产期GBS疾病预防指南》中，明确指出对35～37孕周的妇女进行阴道/直肠GBS定植筛查。

在我国，由于孕产妇人群常规筛查GBS并未大规模普及，国内相关研究资料不全，而根据本实验室研究[3]表明，增菌后的聚合酶链反应GBS检测阳性率9.6%，低于国外文献[4-7]的定植水平。为了解北京地区的GBS的分子流行病学特征与对常用抗菌药物的耐药菌谱情况，以便向临床医师提供有效的预防与诊治，为制订符合本国情况的孕产妇宫内感染预防与诊治指南的确定提供临床与实验室的依据。

1 资料与方法

1.1 GBS菌株收集与鉴定

收集 2016年 7月-2017 年 6月，在民航总医院及北京华府妇儿医院就诊，接受产前检查的孕晚期妇女阴道/直肠拭子所培养出的GBS菌株，每月取检出的前8株，共96株。其中民航总医院的菌株有82株，北京华府妇儿医院收集菌株有14株。菌株的鉴定依据菌落形态(血平皿上呈圆形、边缘整齐、湿润、灰白半透明菌落，多数有典型β-溶血环)，显微镜下形态(革兰阳性链状球菌)，CAMP实验阳性，初步确定是否为GBS，最终采用VITEK-2微生物鉴定仪鉴定。

1.2 GBS菌株血清学鉴定

目前依据GBS上荚膜多糖的不同，分为Ia、Ib、Ⅱ～Ⅸ等10个血清型。采用PCR方法对其进行鉴定。具体引物见表1[4-5]，经基因测序验证无误后使用。

1.3 药敏质控标准

质控菌株选择ATCC 25923金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌 ATCC 49619、ATCC 27853铜绿假单胞菌，质控菌株来源于实验室保存。

1.4 抗菌药物选择

上述96株菌均进行药敏实验，选用的抗生素包括青霉素、氨苄西林、红霉素、克林霉素与万古霉素等，采用微量肉汤法进行药敏表型试验，药敏结果解释参照美国临床和实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)的2017年标准。

1.5 检测方法

对所有分离到的目标病原菌，用无菌0.9%(质量分数)氯化钠注射液配置成0.5麦氏浊度的悬液，按照试剂说明书操作，试剂由天津金章科技发展有限公司提供。

表1 GBS 用于血清型鉴定引物与片段长度Tab.1 Primers and amplified fragment length for the serotype identification of group B Streptococcus

1.6 红霉素耐药菌株诱导克林霉素耐药检测

红霉素耐药和克林霉素敏感或中介的GBS，采用纸片扩散法进行D-抑菌圈试验。15 μg 红霉素纸片和 2 μg 克林霉素纸片间距12 mm，35 ℃孵育16～18 h后，与红霉素相邻侧抑菌圈边缘出现“截平”(称作D-抑菌圈)=诱导克林霉素耐药。在克林霉素抑菌圈内有雾状生长=克林霉素耐药，即使无明显的D-抑菌圈。诱导克林霉素耐药试验阳性，应报告分离株“克林霉素耐药”。

1.7 耐药基因检测

针对红霉素耐药菌株，提取全基因组，耐药基因与所用引物如表2所示，PCR扩增产物经测序后与BLAST基因数据库在线比对。

2 结果

2.1 筛查GBS菌株血清学分布

96株无乳链球菌，最常见的血清型为Ⅲ型(40株，41.7%)，其他血清型V型(18株，18.8%)， Ia型(13株，13.5%)，Ib型 (13株，13.5%)， Ⅱ型 (8株，8.3%)。有4株GBS，PCR法无任何目标条带，为无法分型菌株(nontypeable，NT)，菌株药敏分布见表3。

2.2 抗生素耐药表型

根据药敏结果表明，所有菌株均对青霉素、氨苄西林、万古霉素、头孢噻肟敏感。71%(68株)GBS对于红霉素耐药，69%(66株)对于克林霉素耐药。红霉素耐药菌株中，有63株(65.6%)为cMLSB型，2株(2.1%)为iMLSB 型，M型有5株(5.2%)，L型有3株(3.1%)，而S型占23株(表4)。

2.3 大环内酯耐药基因型分析

经耐药基因检测分析后发现，红霉素的耐药主要与ermB基因相关，有81.4%红霉素耐药菌株携带该基因。

3 讨论

GBS早期称为无乳链球菌，因其最早被确认为是牛乳腺炎的重要致病菌，感染该菌牛奶产量下降，故此得名。20世纪70年代以来，GBS被认为是侵入性新生儿感染的首要致病菌，引起广泛重视[2]。GBS可定植于孕产妇的生殖道/直肠部位，定植可达率10%～30%[2，8]。孕产妇定植GBS是引起新生儿侵袭性感染的首要危险因素。特别是在欧美等发达国家，GBS是新生儿败血症的首位病原菌[9]。

表2 菌株药敏分布类抗生素耐药基因与PCR引物Tab.2 Resistance genes and amplification primers of macrolides in group B Streptococcus

表3 96株定植无乳链球菌菌株药敏与MIC值分布Tab.3 Antimicrobial susceptibility testing results and MIC distribution of 96colonized strains of group B Streptococcus

表4 无乳链球菌对红霉素耐药表型、基因型与血清型相关关系Tab.4 Relationship between erythromycin resistant phenotypes， genotypes and serotypes of group B Streptococcus

MLSB:resistant to macrolides， lincosamides， and streptogramin B. MLSB can be either inducible (iMLSB) or constitutive (cMLSB)

研究[10-13]表明，对于孕晚期妇女生殖道/直肠进行GBS定植筛查，筛查阳性人群在分娩前4 h采用抗生素预防感染，可有效降低新生儿感染的发生率。在美国，近十余年来的孕产妇GBS筛查预防新生儿感染指南的推广，使得GBS感染下降显著[2]。

然而，目前为止，中国大陆地区孕产妇人群生殖道/直肠定植GBS的情况研究较少，定植、感染等相关数据相对缺少，亦未制订相关预防指南[13]。因此，本研究中对于位于北京东部地区产科就诊的人群进行生殖道/直肠定植GBS定植情况筛查，以了解国内GBS菌株的分子流行病学趋势。

实验研究结果表明，国内人群的GBS血清学分布具有如下特征：血清型Ⅲ为最多见的血清型，占所有菌株的41.8%，该数据远高于世界上其他国家的报道，仅有一篇来自韩国的报道[10]与此相近(该报道中血清型Ⅲ占43.8%)；V型、Ia型、Ib型与 Ⅱ型血清型的分布仅次于血清型Ⅲ型。研究中未见血清型Ⅳ型、Ⅳ型、VⅡ型或 IX型、这两种血清型在其他亚洲人群进行的研究中亦较少见[11-12]。

目前的指南[2，9]多推荐采用青霉素对于GBS定植的孕产妇在分娩前预防该菌引起的新生儿感染。欧美等国家目前尚未见青霉素耐药的GBS菌株。但是，亚洲部分地区，已报道[9，14]发现对于青霉素或氨苄西林中介的GBS菌株。本研究中96例GBS菌株均对青霉素与氨苄西林敏感，说明在中国β-内酰胺抗生素依然可作为GBS定植人群预防感染的首要选择。

美国CDC指南[2]亦指出，对于青霉素过敏的孕妇，可采用红霉素或克林霉素替代，然而GBS对于红霉素与克林霉素的耐药率不断上升，引起世界范围内的广泛关注[15]。GBS对大环内酯获得性耐药是通过erm基因(主要为ermB、ermTR)编码的23S rRNA基因甲基化，使大环内酯与靶位结合力下降引起MLSB表型耐药。本研究中发现，国内GBS对红霉素与克林霉素的耐药率(分别为70.8%与68.8%)高于欧美国家的耐药率。同时，表型为cMLSB的GBS菌株占总耐药菌株的首位，而M表型仅占红霉素耐药菌株的5.2%。本研究中发现的GBS对红霉素与克林霉素的耐药率如此之高，表明对于青霉素过敏的患者，采用红霉素或克林霉素作为替代抗生素预防时，必须进行药敏实验。Morozumi等[12]建议，对于大环内酯或林可霉素耐药的GBS菌株，应采用万古霉素进行预防。

总之，本研究结果表明北京地区的GBS菌株的分子流行病学特征与世界其他国家的报道总体相仿，但有其自身特点：①血清型Ⅲ为最多见的血清型；②克林霉素与红霉素耐药极高；③未见青霉素与万古霉素耐药的菌株。