绿豆活性肽对小鼠H22肝癌移植瘤的抑制作用

李梅青，王 康，夏善伟，周 鑫

(1 安徽农业大学 茶与食品科技学院，安徽 合肥 230036；2 合肥农产品加工研究院，安徽 合肥 230036)

绿豆(mung bean)又名青小豆，为豆科草本植物绿豆(Phaseolusradiatus)的成熟种子，其营养成分丰富[1]，蛋白质含量高达19.5%～33.1%[2]，并且具有抗氧化、抗真菌、降血压、降血脂、参与人体代谢以及解毒等多种生理功能[3-8]。绿豆作为我国主要的豆类粮食作物，其栽培面积、总产量和出口量曾居世界首位，品种更是达数千种之多[9]。近年来，人们对绿豆的加工利用多集中于淀粉生产方面，而忽略了蛋白质，造成了蛋白质资源的严重浪费[10]。

肝癌是常见的恶性肿瘤，其死亡率高[11-13]，而且目前的主要治疗手段副作用巨大[14-15]。由非单一氨基酸组成的活性肽类是近几年抗肿瘤研究的热点，国内外专家研究发现，许多活性肽类有很好的肿瘤抑制作用，且对人体毒副作用较小[16-18]。绿豆活性肽是绿豆蛋白水解后的产物，具有抗氧化[19]、降血压[20]、提高免疫力[21]等功效。本课题组前期研究发现，绿豆活性肽能显著抑制人肝癌细胞HepG2的体外增殖活性，其作用效果与灵芝肽相当[22]，远高于玉米肽[23]。为了更加深入地了解绿豆活性肽的体内肿瘤抑制作用，本试验利用荷瘤小鼠考察绿豆活性肽对小鼠移植性肿瘤H22的体内抑制活性，并初步探究其作用机制，旨在为绿豆资源的深度利用和绿豆活性肽在肝癌饮食预防以及病患辅助食品中的应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 主要试剂及仪器 绿豆分离蛋白，购自河南千志商贸有限公司；木瓜蛋白酶，北京索莱宝科技有限公司；小鼠端粒酶(TE)、小鼠B细胞淋巴瘤因子(Bcl-2)、小鼠Bcl-2相关蛋白(Bax)酶联免疫吸附测定试剂盒(ELISA)，伊莱瑞特生物科技有限公司；谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、血尿素氮(BUN)和肌酐(CRE)检测试剂盒，利德曼生化股份有限公司；5-氟尿嘧啶(5-FU)，上海瑞永生物科技有限公司。

Alphal-2冷冻干燥机，英国LABCONCO公司；酶标仪，美国Bio-Rad公司；SC-2556低速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；AL104型电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；KM-23vet全自动血细胞分析仪，上海康美医疗器械有限公司；AU680全自动生化分析仪，贝克曼库尔特商贸有限公司。

1.1.2 试验动物与瘤株 无特定病原体(SPF)级昆明小鼠，体质量18～22 g/只，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物合格证号为SCXK(沪)2012-0002。鼠肝癌H22瘤株由安徽农业大学张劲松教授惠赠。

1.2 试验方法

1.2.1 绿豆活性肽的制备 配制质量浓度为50 g/L的绿豆分离蛋白溶液，在木瓜蛋白酶的作用下进行水解(52 ℃，pH 6.3，酶用量4 500 U/g，酶解2 h)，期间不断以0.5 mol/L的NaOH溶液滴定以维持pH恒定。酶解后沸水浴10 min灭酶，调节pH至绿豆分离蛋白等电点pI为 4.4[24]，沉淀未水解的蛋白，4 200 r/min离心15 min，取上清液冷冻干燥得到粉末多肽。

1.2.2 动物模型的建立和受试方式 将48只小鼠随机分为6组，即正常组、模型组、阳性对照组及绿豆活性肽高、中、低剂量组，每组8只。无菌条件下抽取传代7 d、生长良好的H22荷瘤小鼠腹水，用生理盐水稀释至细胞密度为2×107mL-1，按0.2 mL/只在小鼠的右前肢腋部皮下注射接种上述除正常组外的其他各组小鼠。从接种后第2天开始，连续给药7 d，绿豆活性肽高、中、低剂量组分别灌胃不同质量浓度的绿豆活性肽溶液0.2 mL/只，灌胃剂量分别为400，800和1 600 mg/kg；阳性对照组以20 mg/kg剂量腹腔注射5-FU；正常组和模型组灌胃等体积(0.2 mL)生理盐水溶液。末次给药24 h后称小鼠体质量，麻醉，摘除眼球采集血液样本后处死，完整剥离小鼠肿瘤组织、脾脏和胸腺，备用。

1.2.3 抑瘤率和免疫器官脏器指数的测定 用4 ℃预冷的生理盐水清洗肿瘤组织、脾脏、胸腺表面的血迹和组织液后称质量，按照公式(1)、(2)、(3)分别计算抑瘤率、脾脏指数和胸腺指数。

(1)

(2)

(3)

1.2.4 血液生化指标的测定 采用全自动血细胞分析仪测定小鼠血液中白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)和血小板(PLT)含量；离心收集血清，通过全自动生化分析仪测定小鼠血清中AST、ALT、ALP活性及BUN和CRE含量。

1.2.5 TE、Bcl-2和Bax的测定 将肿瘤组织样本剪碎，称取0.1 g，与0.9 mL PBS(0.01 mol/L，pH=7.4)充分混合后，置于冰上用高速组织匀浆器匀浆，将匀浆液于5 000 r/min离心10 min，按照ELISA试剂盒说明书对肿瘤组织中TE、Bax和Bcl-2的含量进行测定。

1.2.6 数据处理 数据以“平均值±标准差”表示，检测结果均采用SPSS20.0软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA)。

2 结果与分析

2.1 绿豆活性肽对荷瘤小鼠的抑瘤率

由表1可知，阳性对照组和绿豆活性肽高、中、低剂量组荷瘤小鼠瘤质量均低于模型组，其中高、中、低剂量组与模型组差异达显著水平(P<0.05)，阳性对照组与模型组差异达极显著水平(P<0.01)，说明阳性对照组药物和绿豆活性肽对荷瘤小鼠肿瘤的生长均有明显的抑制作用。随着使用剂量的增加，绿豆活性肽对肿瘤的抑制效果也逐渐增强，呈现一定的剂量效应。绿豆活性肽高、中、低剂量组均能不同程度增加荷瘤小鼠体质量，而阳性对照组小鼠体质量极显著低于模型组，说明阳性对照组药物对荷瘤小鼠机体存在明显的损伤，严重影响荷瘤小鼠的生长。

表1 绿豆活性肽对荷瘤小鼠的抑瘤率(n=8)Table 1 Anti-tumor effect of mung bean peptides against tumor-bearing mice (n=8)

注：*表示与模型组相比差异显著(P<0.05)，**表示与模型组相比差异极显著(P<0.01)。下表同。

Note: * means significant differences compared with model groups(P<0.05),** means very significant differences compared with model groups(P<0.01).The same below.

2.2 绿豆活性肽对荷瘤小鼠免疫器官的影响

研究发现，荷瘤小鼠的胸腺常出现萎缩，而免疫促进剂可使其质量恢复至正常水平。在癌变过程中，因肝脏正常血管结构被破坏，受门脉高压形成及机体免疫应答反应的影响，最终会造成脾脏增大[25]。由表2可知，与模型组相比，阳性对照组荷瘤小鼠胸腺指数和脾脏指数均极显著降低，说明5-FU对小鼠具有明显的免疫抑制作用；绿豆活性肽高、中、低剂量组小鼠的胸腺指数和脾脏指数均较模型组升高，其中中、高剂量组脾脏指数与模型组差异达显著水平，说明绿豆活性肽能够增大小鼠免疫器官的质量，增强小鼠的免疫功能。与正常组相比，模型组小鼠胸腺指数显著降低，脾脏指数显著升高。

表2 绿豆活性肽对荷瘤小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响(n=8)Table 2 Effect of mung bean peptides on thymus index and spleen index of tumor-bearing mice (n=8) mg/g

注：模型组与正常组相比，数据后标#表示差异显著(P<0.05)，标##表示差异极显著(P<0.01)。下表同。

Note: # means significant difference between the model group and the normal group(P<0.05),## means very significant difference between the model group and the normal group(P<0.01).The same below.

2.3 绿豆活性肽对荷瘤小鼠血液常规指标的影响

小鼠血液WBC、RBC、HGB和PLT水平的检测结果如表3所示。由表3可知，与正常组相比，模型组小鼠WBC和PLT水平分别显著和极显著升高，RBC和HGB水平无明显变化。阳性对照组小鼠WBC和PLT水平极显著低于模型组。与模型组相比，绿豆活性肽高、中、低剂量组小鼠WBC水平升高，其中中、高剂量组与模型组差异达显著水平；PLT水平降低，其中中、高剂量组与模型组差异达显著水平；RBC和HGB水平无明显变化。上述结果表明，绿豆活性肽能升高荷瘤小鼠的WBC水平，增强机体免疫力。

表3 绿豆活性肽对荷瘤小鼠血液常规指标的影响(n=8)Table 3 Effect of mung bean peptides on haematology index in tumor-bearing mice (n=8)

2.4 绿豆活性肽对荷瘤小鼠肝脏和肾脏功能血清指标的影响

血清中AST、ALT和ALP活性的升高常被作为肝脏功能受损的特异性指标，而BUN和CRE含量的升高是肾脏功能受损的重要指标[26]。由表4可知，与正常组比较，模型组小鼠血清中AST、ALT和ALP活性均极显著升高，BUN和CRE含量无明显变化，说明H22肿瘤能造成小鼠肝组织损伤，对肾脏无明显影响。与模型组比较，绿豆活性肽高、中、低剂量组小鼠血清中AST、ALT和ALP活性均下降，其中低剂量组与模型组差异达显著水平，中、高剂量组与模型组差异达极显著水平；阳性对照组荷瘤小鼠血清中AST、ALT、ALP活性及BUN和CER含量均较模型组升高，其中AST、BUN和CRE与模型组差异达显著水平，ALT和ALP与模型组差异达极显著水平。表明抗癌药物5-FU在发挥治疗作用的同时，对机体的肝脏和肾脏具有明显的损害作用，而绿豆活性肽能显著改善肿瘤对荷瘤小鼠所致的肝组织损伤。

表4 绿豆活性肽对荷瘤小鼠肝脏和肾脏功能血清指标的影响(n=8)Table 4 Effect of mung bean peptides on serum indexes of hepatic and renal functions in tumor-bearing mice (n=8)

2.5 绿豆活性肽对荷瘤小鼠肿瘤组织Bax、Bcl-2表达和TE活性的影响

由表5可知，与模型组比较，阳性对照组和绿豆活性肽高、中、低剂量组荷瘤小鼠肿瘤组织中TE水平极显著下降；Bax水平上升，其中阳性对照组和绿豆活性肽高剂量组与模型组差异达极显著水平，绿豆活性肽中剂量组与模型组差异达显著水平；Bcl-2水平下降，其中阳性对照组与模型组差异达极显著水平，绿豆活性肽高、中剂量组与模型组差异达显著水平。

表5 绿豆活性肽对荷瘤小鼠肿瘤组织Bax、Bcl-2表达和TE活性的影响(n=8)Table 5 Effect of mung bean peptides on Bax,Bcl-2 and TE in tumor tissue (n=8)

以上结果说明，阳性对照组药物和绿豆活性肽均能抑制TE活性，降低Bcl-2蛋白表达，增强Bax蛋白表达，其中阳性对照组药物作用效果最为明显，符合表1中抑瘤率测定结果。

3 结论与讨论

端粒酶在维持癌细胞无限增殖的过程中发挥着重要作用，抑制端粒酶的活性有可能抑制癌的发生与发展，端粒酶被认为是预防和治疗癌症的新靶标[27]。韩雅莉等[28]研究发现，地鳖纤溶活性蛋白对H22实体瘤有一定的抑制作用，其通过降低端粒酶活性、提高Caspase-3表达水平，来诱导癌细胞凋亡。Bcl-2和Bax是近年研究发现的与肿瘤细胞凋亡明确相关的2类蛋白，在细胞凋亡的调控中扮演着重要角色，Bcl-2能使细胞长期存活，抑制细胞凋亡，而其相关蛋白Bax则在功能上与之相反，会促进细胞凋亡[29-30]。Wei等[31]通过体内和体外试验发现，荞麦根提取物对H22肝癌细胞具有显著的抑制作用，并且能显著改善环磷酰胺造成的肝组织损伤，其机制可能与上调Bax的表达和下调Bcl-2的表达有关。

本试验在研究绿豆活性肽肝癌抑制作用的同时，考察了其对小鼠免疫器官、肝脏和肾脏功能的影响，并对其作用机制进行了初步探究。结果表明，阳性对照组药物和绿豆活性肽对荷瘤小鼠肿瘤的生长均有明显的抑制作用，绿豆活性肽高剂量组抑瘤率达32.6%；绿豆活性肽能增大小鼠免疫器官的质量，增强小鼠的免疫功能，改善荷瘤小鼠肿瘤导致的肝组织损伤，而阳性对照组药物显著抑制了小鼠的免疫功能，且对肝脏和肾脏具有明显的损害作用；绿豆活性肽的肿瘤抑制作用可能与抑制TE端粒酶活性、促进肿瘤细胞Bax表达、抑制Bcl-2表达有关。

肝癌是目前影响人类健康的重大疾病，由于起病隐匿、进展迅速，借助化学药物进行化疗是目前常用的治疗手段之一。在临床上，化学药物虽然具有一定的治疗效果，但对机体损害严重，不良反应较大[32]。本试验结果显示，绿豆活性肽的肿瘤抑制作用明显，且能显著改善肿瘤导致的机体损伤，这为绿豆资源的综合利用和将绿豆活性肽开发为保健食品及特殊医学用途配方食品提供了理论依据。