牙周基础治疗对龈沟液中自噬水平的影响

罗 惟，罗世高，白兰军

(四川省医学科学院·四川省人民医院口腔科，四川 成都 610072)

牙周炎是一种非常常见的慢性口腔疾病，临床表现主要为牙周袋形成、牙槽骨吸收和牙齿松动。牙周组织的损害主要由过度的宿主-病原炎性反应间接造成。牙周局部组织中，在牙龈卟啉单胞菌等牙周致病菌的刺激下，宿主自身免疫应答被激活，大量的炎性因子如白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)被合成释放，在引发强烈的炎症反应的同时也会诱发细胞自噬[1]。细胞自噬是一种广泛存在于真核细胞中的生物学过程，可以将细胞内衰老、异常的蛋白质或细胞器运送至溶酶体进行降解清除并循环利用。微管相关蛋白1轻链3(LC3)和Beclin-1蛋白是自噬过程中的重要分子，直接参与自噬体的形成，目前已作为评价自噬活性的标志物[2]。牙周基础治疗(龈上洁治和龈下刮治)是临床上治疗牙周炎的重要方法，对患者龈沟液中炎性因子的表达水平有显著的抑制作用[3，4]，但对龈沟液中细胞自噬水平的影响还暂无报道。本研究对成人牙周炎患者进行龈上洁治和龈下刮治，比较治疗前后牙周临床指标和自噬水平的变化。

1 资料与方法

1.1一般资料纳入2016年4月至2017年2月在四川省人民医院口腔科门诊就诊的成人牙周炎患者21例，其中男11例，女10例，年龄35～59岁[(46.5±7.1岁)]。纳入标准[5]:口腔内天然牙在20颗以上，牙龈红肿出血、牙周溢脓，牙周袋深度≥5 mm，X射线片显示牙槽骨吸收超过根长的1/3，患牙数目在8颗以上。无系统性疾病，半年内未接受过牙周治疗、三个月内未使用过抗生素和非甾体类抗炎药物，女性非妊娠期。所有受试者均签署知情同意书。

1.2方法在符合要求的患牙中选取A6颊侧为实验牙来收集龈沟液样本并记录术前牙周临床指标，然后对患者行全口龈上洁治和龈下刮治。两周后复查时再次收集A6颊侧的龈沟液样本并记录牙周临床指标。在整个实验期间，患者不得接受其他牙科治疗，不得使用任何抗生素和抗炎药物。①牙周临床指标的检测。由两名受过口腔专业训练的研究者分别检查患者的口腔卫生状况并记录相应指标:牙龈指数(gingival index，GI)，牙周探诊深度(probing depth，PD)和临床附着丧失(clinical attachment loss，CAL)。经检验，检查者进行临床检测的一致性良好(kappa = 0.85)。②龈沟液的收集与检测。将实验牙隔湿并去除龈上菌斑，把龈沟液专用滤纸条Periopaper(Oraflow Inc.，Smithtown，USA)插入该牙牙周袋内30秒后取出(若有血则弃之重来)，用龈沟液测量仪Periotron8000(Oraflow Inc.，Smithtown，USA)测定液量，再将滤纸条放入含200 μl生理盐水的离心管中于-20 ℃冻存待用。采用双抗ELISA法试剂盒(LifeSpan Biosciences，Seattle，USA)对龈沟液样本中的LC3和Beclin-1进行标记，在450 nm处测OD值，根据标准曲线计算浓度。

1.3统计学方法采用IBM SPSS Statistics 19.0软件进行统计分析。所有数据均为连续性变量，以均数±标准差表示。牙周治疗前后数据的比较采用配对t检验，牙周临床指标和自噬水平的关联采用Pearson相关性分析。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1牙周基础治疗前后临床指标的变化牙周基础治疗前后各项牙周临床指标均有不同程度的下降且差异均有统计学意义。见表1。

表1 牙周基础治疗前后临床指标的变化

2.2牙周基础治疗前后龈沟液自噬水平的变化经过牙周基础治疗，患者龈沟液中的自噬相关指标LC3和Beclin-1的表达水平均有降低，且差异均有统计学意义。见表2。

表2 牙周基础治疗前后龈沟液自噬水平的变化 (ng/ml)

2.3牙周临床指标与龈沟液自噬水平的相关性牙周治疗前，即未接受治疗的成人牙周炎状态下，牙周临床指标与龈沟液自噬水平均呈现正相关性；在牙周治疗后，仅GI与自噬指标存在显著的正相关性，PD或CAL与自噬指标之间无相关性。见表3。

2.4牙周临床指标降低程度与龈沟液自噬水平降低程度的相关性ΔGI和ΔLC3、ΔBeclin-1之间均呈现正相关(P< 0.001)。而ΔPD、ΔCAL与ΔLC3、ΔBeclin-1之间则无相关性(P> 0.05)。见表4。

表3 牙周临床指标与龈沟液自噬水平的Pearson相关性分析

*P< 0.05，**P< 0.01

表4 牙周临床指标降低程度与龈沟液自噬水平降低程度的Pearson相关性分析

3 讨论

牙周常见致病菌的多种毒力因子(脂多糖、肽聚糖和细菌DNA等)均可参与牙周组织的破坏，通过与宿主细胞的Toll 样受体(Toll-like receptor，TLR)直接结合来激活自身免疫应答，炎性因子大量合成、炎性细胞浸润，从而导致局部炎症反应。在自身免疫应答激活的同时，细胞自噬也被激活，而自噬可以调控TLR等信号通路，与炎症反应形成反馈调节机制。牙龈卟啉单胞菌产生的脂多糖可以通过活性氧自由基激活牙龈成纤维细胞的自噬反应[6]。LC3主要表达于自噬体，通过调控微管蛋白的组装来介导自噬体形成；Beclin-1则表达于反面高尔基网状结构，参与自噬前体的产生和自噬体的形成[7]。牙周炎状态下，牙周膜组织中的LC3、Beclin-1表达上调，自噬体大量生成，进而防止细胞过度凋亡，保护牙周组织[8]。

龈上洁治术和龈下刮治术作为牙周基础治疗的核心组成部分，是临床上治疗牙周炎的常用手段。多项研究[9～11]证实，慢性牙周炎患者在经过龈上洁治和龈下刮治等牙周治疗后，随着菌斑、牙石等局部刺激因素的去除，牙周局部组织特别是龈沟液中的多种炎性因子如前列腺素E2、TNF-α、IL-6、IL-8和IL-35的表达水平均有明显的下降，各种牙周临床指标也得到很大的改善。由于细胞自噬跟炎症反应之间存在密切的反馈调节，牙周治疗很有可能对牙周组织的自噬水平也有抑制作用。本研究首次对牙周基础治疗前后患者龈沟液中的自噬水平进行了比较，发现在接受牙周基础治疗两周后，龈沟液中的自噬相关指标LC3和Beclin-1的表达水平均有明显降低。龈沟液中LC3和Beclin-1水平的降低提示牙周组织中自噬体合成的减少以及自噬反应的下调。

本研究还发现在炎症状态下，牙周临床指标与龈沟液自噬水平存在正相关性；然而在牙周治疗后，仅GI与自噬指标存在正相关性。这可能是因为牙周治疗后虽然炎症水平得到了控制，自噬跟炎症反应之间并不完全同步。另外ΔGI和ΔLC3、ΔBeclin-1之间呈现出正相关性，这说明自噬水平的降低可能跟牙龈组织的改善关联更大。炎性反应对于宿主来说本身就是一把双刃剑，自噬跟炎症反应的关联又相当复杂，所以不能只根据自噬水平的高低来衡量牙周炎的严重程度。总的来说，牙周基础治疗可以有效地控制成人牙周炎患者龈沟液中的自噬水平，LC3和Beclin-1有希望成为评价牙周临床治疗效果的重要指标。