大孔树脂分离对银杏外种皮多酚抗氧化及抑菌活性的影响

郭佩佩 张雪娟 马永珍 徐艳

摘要：以银杏（Ginkgo biloba L.）外种皮为原料，乙醇回流提取粗多酚，选择D-101型大孔树脂纯化，分别用30%、50%、70%、90%乙醇洗脱，考察不同洗脱物的多酚含量及抗氧化抑菌活性，研究大孔吸附树脂纯化对银杏外种皮多酚抗氧化及抑菌活性的影响。结果表明，90%乙醇洗脱物多酚含量最高，抗氧化活性最强。胡萝卜汁产生菌的抑菌结果表明，90%乙醇洗脱物的抑菌活性明显高于粗提物。D-101型大孔树脂适用于银杏外种皮多酚的初步纯化。

关键词：银杏（Ginkgo biloba L.）果肉质种皮；多酚；抗氧化；抑菌活性；大孔树脂

中图分类号：R931.6；R282 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2018）11-0075-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.11.018

Abstract： The total polyphenols were extracted by ethanol reflux method， and the D-101 macroporous resin was used to purify the total polyphenols to study the effect of antioxidation and antibacterial activities on polyphenols from ginkgo（Ginkgo biloba L.） fruit sarcotesta separation by macroporous adsorption resin. The macroporous adsorption resin was eluted by 30%，50%，70%，90% ethanol and to inspect the polyphenol content and the antioxidant and antibacterial activity of different elution. Results showed that 90% ethanol elution had the highest polyphenol content and the highest antioxidant activity. The results showed that the antibacterial activity of 90% ethanol elution on the bacteria from carrot juice was significantly higher than that of crude extract. D-101 macroporous resin is suitable for the preliminary purification of polyphenols from ginkgo fruit sarcotesta.

Key words： ginkgo（Ginkgo biloba L.） fruit sarcotesta；polyphenol；antioxidant；antibacterial activity；macroporous resin

随着人们对疾病的深入研究发现，一些慢性疾病如心血管疾病、癌症、衰老等均是体内自由基失衡对机体产生氧化性损害，如果这种损害不能及时修复并且逐渐积累到一定程度，往往就会导致疾病的出现[1]。外源性抗氧化剂有助维持人体内自由基的平衡。但人工合成抗氧化剂毒副作用较大，对人体肝、脾、肺等均有不利影响。通过对具有抗氧化活性的天然物质进行筛选，可开发出有效的抗氧化药物和天然保健食品[2]。

天然多酚类化合物是植物体内最丰富的次生代谢产物，其分子结构中含有若干个酚羟基，研究表明多酚类化合物具有降血糖、降血脂、抗炎抗菌、抗病毒和抗癌等多种活性[3]，而且还具有较强的抗氧化作用和清除自由基的能力[4，5]，其多酚含量与抗氧化能力大小成正比[6，7]。银杏（Ginkgo biloba L.）果，俗称白果，由于其营养丰富，自古以来被当作养生延年的上品[8]。对银杏叶和果的研究，尤其是对银杏叶黄酮的研究，已取得了多项成果，但对银杏外种皮的研究还较少，银杏种子硬壳外面的肉质部分，长期以来被视为废物丢弃，研究和实施从银杏外种皮中提取有用的成分，充分利用银杏副产物，变废为宝，还可以解决银杏产区银杏外种皮对环境的污染[9]。本研究以沈阳农业大学校园内银杏外种皮为材料，研究D-101型大孔吸附树脂纯化对多酚抗氧化活性的影响，为银杏多酚天然抗氧化剂的生产提供理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

外果皮：银杏果，2016年10月采自沈阳农业大学校园内，去核，于-25 ℃冰箱中凍存备用。

试剂：D101大孔树脂（批号：20110527）；没食子酸标准品（中国药品生物制品定所，纯度98%）；大孔树脂（西安蓝晓科技有限公司）；氯化硝基四氮唑蓝（上海恒星应用化学研究所）；核黄素（北京奥博星生物技术责任有限公司）；DPPH（A Johnson Matthey Company）。

仪器：722型可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；日光灯反应箱，自制；CJ-2N超净工作台（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）；I-IPX-9272MBE电热培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）。

1.2 方法

1.2.1 银杏果多酚的提取 称取银杏外种皮，乙醇回流提取，提取2次，过滤，滤液浓缩离心，蒸干，蒸干物三氯化铁检测呈阳性，得到银杏果多酚粗提物。

1.2.2 大孔树脂对银杏果多酚的吸附洗脱

1）大孔树脂预处理。准确称取一定量的D-101大孔树脂，无水乙醇浸泡24 h，用去离子水洗去乙醇至无醇味，然后用1 mol/L的NaOH溶液浸泡24 h，去离子水洗至中性，再用1 mol/L的HCl浸泡24 h，去离子水洗至中性备用[10]。

2）静态吸附的动力学曲线。取处理好的D-101大孔吸附树脂2 g装入250 mL具塞磨口三角瓶中，加入已知浓度的粗提液50 mL，置于振荡器中，使吸附饱和，每间隔1 h取样，过滤，收集流出液，测定多酚含量，绘制出银杏果多酚静态吸附的动力学曲线[11]。

3）不同乙醇体积分数洗脱液及用量对多酚得率的影响。取处理好的树脂，湿法装柱，加入拌样树脂，去离子水洗脱至无色，分别用30%、50%、70%、90%乙醇洗脱，每种体积分数乙醇洗脱1 BV后收集洗脱液，干燥，测定干燥物中多酚含量。

1.2.3 多酚含量的测定 采用福林-酚法测定多酚含量[12]。称取没食子酸标准品1.000 g，用去离子水溶解并定容至1 000 mL。从中分别移取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于100 mL 容量瓶中，定容。分别吸取上述溶液1 mL，加入到10 mL容量瓶中，各加入5.0 mL 10%福林酚试剂，振摇，反应6 min后加入4.0 mL 7.5%碳酸钠溶液，用去离子水定容，摇匀，静置1 h后于766 nm处测定吸光度，得到没食子酸浓度与吸光度的标准曲线。将待测物质设置成浓度梯度，根据标准曲线计算出待测物质多酚含量。

1.2.4 抗氧化活性的测定 清除DPPH·活性的测定采用提取物与稳定自由基DPPH·反应的分析方法[13]。清除超氧自由基活性的测定采用光照核黄素体系产生超氧自由基法[14]。清除羟自由基活性的测定参考文献[15]。还原力的测定采用铁离子还原法（FRAP）和铁氰化钾还原法[16]。

1.2.5 抑菌活性的测定 取胡萝卜汁中长出的菌体于直径9 cm牛肉膏蛋白胨平板中划线，37 ℃活化24 h。将菌苔刮入去离子水中制成菌悬液，用微量进样器抽取100 μL菌悬液接入牛肉膏蛋白胨平板中，均匀涂布。将牛津杯用镊子轻轻夹取，放置于铺好培养基的平板上，再用微量定量移液器准确吸取0.2 mL供试品小心移入6 mm×10 mm牛津杯中，杯中分别加入丙酮、10 mg/mL山梨酸、粗提物，大孔树脂洗脱物各200 μL。平稳放置于恒温培养箱内37 ℃下培养16 h。待出现明显抑菌圈后，量取抑菌圈直径。

2 结果与分析

2.1 大孔树脂最佳工艺条件的确定

2.1.1 静态吸附的动力学曲线 由静态吸附动力学曲线（图1）可以看出，4 h后，吸附质量浓度随时间的增加变化很小，即大孔树脂已基本达到饱和。说明大孔树脂对银杏果多酚的吸附属于快速平衡型，快速吸附可缩短生产周期，这在工业上是有利的。

2.1.2 不同体积分数乙醇洗脱液及用量对多酚含量的影响 将银杏果肉质种皮醇溶性粗提物上大孔树脂柱，分别采用水洗，30%、50%、70%、90%乙醇进行洗脱，每种体积分数的乙醇洗脱1 BV后收集洗脱液，干燥，测定干燥物中多酚含量。收集各洗脱液，结果分别为水洗液无色，30%乙醇洗脱液B（乳白色），50%乙醇洗脱液C（黄色），70%乙醇洗脱液D（黄褐色），90%乙醇洗脱液D（褐色），将各洗脱液蒸干，由于水洗物和30%乙醇洗脱物含量过少，无法进行测试，将50%、70%、90%乙醇洗脱物及粗提物进行多酚含量和抗氧化活性测定，结果见图2。

从图2可以看出，50%、70%乙醇洗脱物多酚含量较少，90%乙醇洗脱物多酚含量较高。当洗脱剂用量达到5 BV树脂体积时，洗脱液中多酚含量已经接近0，可认为所用体积分数的乙醇将大孔树脂上的多酚已基本洗脱完全，可以停止洗脱。

2.2 大孔树脂洗脱物抗氧化活性的测定

从图3、图4、图5可以看出，大孔树脂50%、70%、90%乙醇洗脱物对DPPH自由基、氧自由基、羟自由基均具有一定的清除能力，且90%乙醇洗脱物的清除能力明显高于其他2种洗脱物，而且90%乙醇洗脱物的清除能力还高于乙醇粗提物，说明经过大孔树脂分离纯化后，银杏果肉质种皮醇溶性提取物对自由基的清除能力得到了提高。

从图6可知，大孔树脂50%、70%、90%乙醇洗脱物对Fe3+均具有一定的还原能力，说明其中均含有一定的还原性物质。各样品对Fe3+的还原能力随样品量的增加而增强。90%乙醇洗脱物还原性最强，明显高于乙醇粗提物，这也进一步验证了还原力与抗氧化活性呈正相关。

2.3 大孔树脂洗脱物对胡萝卜汁产生菌的抑制作用

采用平板法考察了银杏外种皮多酚对胡萝卜汁中混合菌的抑制效果。从抑菌圈试验可以看出，丙酮、山梨酸、粗提物和90%乙醇洗脱物的抑菌圈直径分别为0、1.6、1.3、1.6 cm。粗提物虽有抑菌作用，但大孔树脂90%乙醇洗脱物抑菌活性明显提高，与抑菌剂山梨酸抑菌活性相同。

3 结论

银杏外种皮多酚抗氧活性研究结果表明，银杏果多酚对DPPH·、超氧陰离子自由基和羟基自由基均有很强的清除效果，说明银杏果多酚具有较强的抗氧化活性。将D-101大孔吸附树脂应用于银杏外种皮多酚的吸附分离，结果所得产物抗氧化、抑菌活性均有提高，可用于银杏外种皮中有效成分的富集分离。

参考文献：

[1] HALLIWELL B，WHITEMAN M. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture：How should you do it and what do the results mean？[J].Brit J Pharma-col，2004，142（2）：231-255.

[2] 尤 新.食品抗氧化剂与人体健康[J].食品与生物技术学报，2006，25（2）：1-7.

[3] MONICA L，NINO R，MARIROSA T. The molecular basis of working mechanism of natural polyphenolic antioxidants[J].Food Chem，2011，125：288-306.

[4] DUCHNOWICZ P，BORS M，PODSEDEK A，et al. Effect of poly-phenols extracts from brassica vegetables on erythrocytemembranes（in vitro study）[J].Environ Toxicol Phar，2012，34： 783-790.

[5] QIN X Y，CHENG Y，YU L C，et al. Potential protection of green tea polyphenols against intracellular amyloid beta-in-duced toxicity on primary cultured prefrontal cortical neu-rons of rats[J].Neurosci Lett，2012，2：170-173.

[6] 石 碧，狄 瑩.植物多酚[M].北京：科学出版社，2000.

[7] LAPIDOT T，GRANIT R，KANNER J. Lipid hydroperoxidase activity of myoglobin and phenolic antioxidants in simulated gastric fluid[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2005，53（9）：3391-3396.

[8] 曹福亮.中国银杏志[M].北京：中国林业出版社，2007.

[9] 赵肃清，李 锋.银杏外种皮研究进展[J].武汉植物学研究，2000，18（6）：515-5180.

[10] 周 玫，梁志远，甘秀海，等.D101大孔树脂富集白术内酯Ⅰ和III工艺研究[J].安徽农业科学，2016，44（24）：131-135.

[11] 孙启文，吴 松，方 芸.D101大孔树脂纯化雪荔组方总黄酮工艺[J].中成药，2014，36（10）：2208-2211.

[12] SUN Y，XU W Q，ZHANG W Q，et al. Optimizing the extraction of phenolic antioxidants from kudingcha made from Ilex kudingcha C. J. Tseng by using response surface methodology[J]. Separation & Purification Technology，2011，78（3）：311-320.

[13] 杨玉娈，陈丽丽，杜雨芊，等.河蚬多肽的理化特性及抗氧化性质[J].中国调味品，2016，41（12）：59-73.

[14] 徐 艳，丁 静，孙桂红，等.猴头菌丝多肽的制备及抗氧化活性研究[J].中国酿造，2014，33（6）：91-95.

[15] 陆武祥，王东华，王秀英，等.5种食用菌液体发酵菌丝抗氧化活性分析比较[J].食品与发酵工业，2013，39（7）：124-127.

[16] 王忠和，王 军，胡慧娟.模式类黑精及其分级产物清除自由基能力、抗氧化性及还原力分析[J].食品与发酵工业，2016，42（1）：92-96.