杜仲总黄酮对去卵巢大鼠骨组织代谢的影响

李三华 陈全利 杨加强

(遵义医科大学，贵州 遵义 563099)

绝经后骨质疏松(PMOP)主要原因是绝经后卵巢合成的雌激素减少，进而导致的内分泌紊乱造成骨吸收增多而使骨形成和骨吸收的平衡被打破。杜仲具有补肝肾、强筋骨之功效。前期试验发现杜仲总黄酮(TFE)在体外具有促进大鼠成骨样细胞增殖和护骨素mRNA表达等作用〔1～3〕。本文拟分析TFE对去卵巢大鼠骨组织代谢的影响。

1 材料与方法

1.1材料 6月龄SD雌性大鼠购自第三军医大学大坪医院实验动物中心，杜仲购自遵义市中药材市场；戊酸雌二醇(拜耳医药保健有限公司)；大鼠Ⅰ型前胶原氨基端肽(PINP)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒和β-Ⅰ型胶原交联羧基末端肽(β-CTXⅠ)ELISA试剂盒(上海西唐生物科技有限公司)；体视显微镜(德国LEICA，M125)；小动物双能X射线骨密度仪(美国Faxitron，DHX)。

1.2TFE的提取 杜仲树皮粉碎成粉末后过60目筛，精密称重1 kg，加入60%乙醇1.2 L，在微波功率200 W条件下加热提取20 min，过滤，提取2次，合并滤液，减压旋转蒸发后烘干至恒重得到杜仲皮提取物；再经AB-8大孔吸附树脂纯化，采用70%乙醇洗脱、富集、浓缩干燥得到TFE 38 g，总黄酮用无菌双蒸水配制成混悬液备用。

1.3骨质疏松大鼠模型的制作 6月龄雌性SD大鼠36只，随机选取30只按30 mg/kg 的剂量腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，仰卧固定于手术台，常规消毒备皮后于腹腔下部正中切开约1 cm长切口，找出双侧卵巢并摘除，术毕伤口内注射硫酸庆大霉素1万U，缝合肌肉皮肤并常规消毒。余下6只切开腹腔不摘除卵巢并缝合腹腔作为假手术组。

1.4动物分组及处理 去卵巢手术1 w后，30只去卵巢大鼠随机平均分为模型组、TFE低、中、高剂量组和雌二醇组，假手术组和模型组只自由进食饮水；TFE低、中、高剂量组在自由进食饮水的基础上，分别灌胃50、100、200 mg·kg-1·d-1TFE，持续5 d/w；雌二醇组在自由进食饮水的基础上，每周灌胃2次戊酸雌二醇，每次1.5 mg/kg体重。实验处理持续12 w。

1.5观察指标 实验结束后麻醉处死大鼠，腹主动脉取血，室温无菌静置凝固1 h,2 000 r/min离心10 min收集血清，按ELISA试剂盒说明书测定血清PINP和β-CTXⅠ的浓度；取右侧股骨于小动物双能X射线骨密度仪上测量骨密度和骨矿物质含量；取右侧胫骨经不脱钙切片后进行VanGieson染色于显微镜下观察骨胶原的表达，测量粉红色染色区域面积在骨组织中的面积比(骨胶原面积比)。

1.6统计学方法 采用SPSS13.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1TFE对去卵巢大鼠血清指标的影响 与假手术组相比，模型组PINP和β-CTXⅠ水平均显著增加(P<0.05)；与模型组相比，TFE中、高剂量组PINP浓度显著升高(P<0.05)，TFE中、高剂量组及雌二醇组β-CTXⅠ浓度显著降低(P<0.05)。见表1。

2.2TFE对去卵巢大鼠骨组织的影响 与假手术组比较,模型组、TFE低、中、高剂量组和雌二醇组股骨骨密度、骨矿物质含量和胫骨骨胶原面积均明显降低(P<0.05)；与模型组相比，TFE中、高剂量组骨密度和骨胶原面积比显著回升(P<0.05)；TFE各组骨矿物质含量均显著增加(P<0.05)。模型组和TFE低剂量组骨胶原比较稀疏，TFE中、高剂量组和雌二醇组骨胶原增多，分布较为密集，见表1，图1。

表1 各组血清和骨组织指标比较

1)与假手术组比较，2)与雌二醇组比较，3)与TEF高剂量组比较，4)与TEF中剂量组比较，5)与TEF低剂量组比较：均P<0.05

图1 各组骨胶原VanGieson染色(标尺长度2 mm)

3 讨 论

雌激素在骨生长、矿化和细胞的分化及功能活性中发挥重要作用；随着年龄的增加，女性雌激素水平下降，成骨细胞的数量和活性逐渐下降，而破骨细胞的数量和活性逐渐增强，导致骨高转换且骨吸收活动强于骨形成，因而骨密度降低，骨的显微结构退变和骨质丢失，进而导致骨的脆性增加，骨折风险增高。雌激素降低是导致绝经期妇女骨质疏松的重要原因，对于PMOP的治疗，临床上多以补充外源性雌激素的方法即传统的雌激素替代治疗和选择性雌激素受体调节剂(SERM)为主要方法,但都有一定的副作用，增加卵巢癌、子宫内膜癌等疾病的风险〔4，5〕。黄酮类物质是植物雌激素的一种，广泛存在于蔬菜、水果和药用植物等中。杜仲中的黄酮类物质主要包含槲皮素、山奈酚、紫云英苷和芦丁〔6，7〕，笔者前期实验提示TFE可能具有防治骨质疏松的功效〔1～3〕。

骨是持续进行骨重建的动态器官，骨重建过程包括成骨细胞成骨和破骨细胞溶骨；PINP 和β-CTX能够快速且灵敏地反映骨形成和骨吸收的状态，动态反映机体内骨重建的状况〔8〕。骨密度是指骨矿物质密度，反映骨形成和骨吸收的平衡状态，骨密度检测是预测绝经后骨丢失的灵敏指标之一，是判定骨质疏松的“金标准”〔9〕。骨胶原是骨有机质的主要成分，不仅为骨的矿化提供基本场所，还与骨细胞的发育、生长和活性调节有关，其含量、结构和稳定性直接影响骨微结构和骨生力学特性,对维持骨的质量有重要作用。本实验揭示了雌激素缺乏的大鼠其骨形成和骨吸收都在增强的骨高转换特点；且雌激素缺乏后骨的吸收活动强于骨形成；TFE可能抑制了骨吸收同时也促进了骨的形成。本文结果表明TFE对雌激素缺乏SD大鼠的骨组织具有保护作用。

4 参考文献

1李三华，何志全，陈全利，等.杜仲总黄酮对大鼠成骨细胞护骨素表达的影响〔J〕.安徽农业科学,2011；39(25)：15279-82.

2李三华，何志全，陈全利，等.杜仲总黄酮对成骨细胞增殖及Ⅰ型胶原蛋白表达的影响〔J〕.西北药学杂志,2011；26(4)：272-4.

3李三华，莫宁萍，刘坤祥，等.RT-PCR法检测杜仲总黄酮对大鼠成骨细胞骨钙素表达的影响〔J〕.遵义医学院学报,2011；8(34)：1-3.

4Lacey JV，Mink PJ，Lubin JH，etal.Menopausal hormone replacement therapy and the risk of ovarian cancer〔J〕.JAMA,2002；288(4)：334-41.

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8Mountzios G，Terpos E，Syrigos K，etal.Markers of bone remodelingand skeletal morbidity in patients with solidtumors metastatic to the skeleton receiving the biphosphonatezoledronic acid〔J〕.Transl Res,2010；155(5)：247-55.

9Corina M，Vulpoi C，Brǎnisteanu D.Relationship between bone mineral density，weight，and estrogen levels in pre and postmenopausal women〔J〕.Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi,2011；116(4)：946-50.