农田土壤硝化反硝化作用及其对生物炭添加响应的研究进展*

赵光昕，张晴雯，刘杏认**，田秀平



农田土壤硝化反硝化作用及其对生物炭添加响应的研究进展*

赵光昕1, 2，张晴雯2，刘杏认2**，田秀平1**

（1. 天津农学院农学与资源环境学院，天津 300384；2. 中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所，北京 100081）

氧化亚氮（N2O）是重要的温室气体之一，还会破坏大气臭氧层，影响全球气候变化。农田土壤是N2O最主要的排放源，由微生物主导的硝化和反硝化作用是其最主要的排放途径，因此，土壤的硝化和反硝化作用备受关注。在综合国内外相关研究的基础上，就区分硝化和反硝化作用对N2O排放贡献的研究方法、土壤N2O产生途径及其影响因素以及施用生物炭对N2O排放的影响机理进行归纳总结。结果表明：硝化和反硝化作用对生物炭的响应不同，在N2O减排效应上也存在很大的不确定性，其内在机理尚不明确。在此基础上，提出区分硝化和反硝化作用对N2O排放贡献的最佳研究方法，并就农田土壤硝化反硝化作用的影响因素以及对生物炭的响应机制进行研究展望。

氧化亚氮；硝化抑制剂；土壤微生物；功能基因

氧化亚氮（N2O）是重要的温室气体之一，其增温潜势是二氧化碳（CO2）的310倍左右，工业化以来大气中N2O的浓度从270 mg·kg−1增至324 mg·kg−1[1]。与CO2和甲烷（CH4）不同的是，N2O气体不仅引起温室效应，还对位于平流层的臭氧层造成不可恢复的破坏，对人类的生活健康造成威胁。因此，N2O在大气中的浓度变化及其对全球气候变化的影响备受关注[2]。据估计，大气中至少70%的N2O来自农业生态系统。其中，农田土壤的硝化反硝化作用是产生N2O的主要途径，是N2O排放的主要来源[3]。中国是世界上氮肥施用最多的国家之一，随着氮肥施用量逐年增加，N2O的排放量也逐渐增加。因此，探明硝化反硝化作用对农田土壤N2O排放的相对贡献，并针对性地采取减排措施是农业应对全球气候变化的迫切需求。

多数情况下，硝化过程和反硝化过程在土壤中是同时发生的，相关微生物的硝化作用和反硝化作用会同时产生N2O。由于土壤条件的异质性和微生物活性状况的复杂性，多数情况难以准确区分硝化与反硝化过程。近年来，区分硝化反硝化作用产生N2O途径的研究方法主要有抑制剂添加法、同位素标记法和气压过程分离方法（BaPS）等。

生物炭是通过在缺氧条件下将生物质包括农业废物、动物粪便和工业木材副产物等进行热解转化生产的具有相对较高碳含量、理化性质稳定、孔隙度和比表面积大的固体物质，生物炭表面含有丰富的含氧官能团可以与H+结合，能够减轻土壤酸化，提高氮肥利用率；农业循环中利用其较高的含碳量，可以达到土壤碳封存的目的[4-6]。近年来，生物炭用于温室气体减排的研究逐渐增加[7-9]，多数研究表明，施用生物炭能够改善土壤的理化性质，影响土壤的硝化反硝化过程，间接影响土壤N2O排放[10-14]，为生物炭的合理利用提供了大量依据。区分并准确测定硝化作用和反硝化作用对N2O排放的贡献，有助于深入理解生物炭对土壤N2O排放的影响机理，目前相关研究报道尚不多见。为此，本研究综述就区分土壤N2O排放贡献的方法，N2O产生的关键微生物过程和生物炭对N2O排放的响应机制进行总结，并对农田土壤硝化反硝化作用以及生物炭的研究重点和方向进行展望，以期为减缓气候变化及生物炭的广泛应用提供一定的理论依据。

1 区分硝化与反硝化对N2O排放贡献的方法

1.1 抑制剂添加法

抑制剂添加法是通过添加一些外源物质或底物来选择性地对硝化作用或者反硝化作用进行抑制，阻止其产生N2O。此方法是通过测定一定时间段内不同抑制处理的N2O排放通量，采用差减法计算未被抑制过程的N2O排放贡献，从而算出土壤对产生N2O的贡献率。在硝化的两步反应中，氨氧化菌和亚硝化菌其中任何一步反应被抑制，整个硝化反应就会被抑制。硝化抑制剂通过抑制硝化过程的酶活性来抑制土壤中NH4+向NO3−的转化。最常见的硝化抑制剂主要有双氰铵（DCD）、乙炔（C2H2）、2−氯−6三氯甲基吡啶（CP）等[15]。其中实验室应用最广泛的抑制剂C2H2能够被氨单加氧酶催化生成一种活性很强的不饱和环氧化物，该环氧化物可以与氨单加氧酶的活性位点共价结合，抑制酶对NH4+的催化[16]。反硝化过程主要由厌氧微生物主导，即实验室常用纯氧或者C2H2和纯氧结合来抑制反硝化作用[17-18]。

C2H2抑制技术可用于小面积和大面积的反硝化常规测定以及研究氮循环过程，研究表明低浓度C2H2（0.01%～0.1%）能够抑制自养氨氧化过程，即抑制硝化作用N2O的产生与排放，C2H2含量为0.1%～1.0%时，可以抑制反硝化过程N2O还原成N2。C2H2抑制法的缺点在于操作复杂不易控制，首先C2H2的扩散会受到土壤含水量及其它结构因素的影响，导致浓度分布不均匀，其次由于抑制了NO3−的生成，硝化作用和反硝化作用可能被C2H2同时抑制。所以，C2H2抑制技术适合在小的空间尺度上对硝化反硝化作用进行区分[19]，然而进行试验时不可避免地将土壤样本采集到实验室，这会对测定结果产生不可预测的偏差[20]。虽然C2H2是目前效果最好的抑制剂，但是C2H2抑制法仍然存在一些问题，如土壤中某些微生物能利用C2H2作为碳源，从而消耗C2H2；C2H2会影响微生物的呼吸作用，以及在土壤中的扩散是否均匀等。

1.2 同位素标记法

氮（N）元素在自然界中存在两种天然同位素，分别为14N和15N，其中14N占比99.63%。N同位素示踪法主要利用15N对NO3−库或NH4+库进行标记，通过对底物NO3−库和NH4+库的变化量以及硝化反硝化作用产生气体的量进行测定，计算硝化反硝化过程对N2O生成的贡献[21]。然而添加15N标记的NH4+或NO3−改变了土壤硝化作用或反硝化作用的基质供应水平，从而可能影响硝化和反硝化过程，因而可能无法真实反映田间条件下的真实状况。同位素标记法通常与C2H2抑制结合使用，C2H2作为气体比其它抑制剂更容易迅速进入土壤阻止硝化作用[22]。虽然抑制剂法和15N示踪技术单独使用或结合使用均可很好地分析土壤中硝化反硝化对N2O排放产生的贡献，但是均无法确定哪些菌对N2O的贡献最为显著，还应结合分子生态学的方法对复杂的硝化反硝化微生物群落结构进行研究。将稳定同位素和分子生物学方法相结合，不仅可以对N2O的排放量进行准确测定，而且还可以确定自养硝化、异养硝化以及反硝化作用对N2O排放的相对贡献[23]。由于抑制剂的加入，常常会不同程度地影响其它反应生成N2O，导致各步骤产生N2O的量被低估，双同位素（15N和18O）自然丰度法和同位素位嗜值（site preferences）为区分硝化和反硝化对N2O排放的贡献提供了新的思路[24]。通过15N和18O双重标记，可以观测N2O形成过程中的N库和O库的变化，并分析出硝化反硝化过程产生的N2O中N和O原子的来源，从而区分硝化反硝化作用对N2O排放的贡献。然而双同位素标记法由于设备昂贵和操作要求，阻碍了其在区分硝化反硝化过程中的准确性和适用性，并且18O同位素相关研究数据较少，不利于分析。同位素位嗜值又称位点偏好，不同微生物过程和官能团具有不同的位点偏好，且合成14N2O和15N2O所需的能量不同，根据以上原理将同位素的相对比例转化为同位素异构体的比例，并利用同位素位嗜值作为参数来量化硝化反硝化作用对N2O形成的贡献[25]。

1.3 气压过程分离法

气压过程分离法（Barometric process separation, BaPS）主要用于测定微生物的生理活动对土壤碳氮转化速率的影响，是一种区分土壤硝化反硝化作用贡献的新方法。BaPS系统是基于土壤样品的CO2、O2和总气体平衡的测定，通过测定系统中压力的变化来计算N2O等气体的产生量。BaPS测量方法采用仪器配套的环刀进行采样和测量，与乙炔抑制法和同位素示踪法相比，减小了人工处理对土壤的干扰，可以真实反应土壤微生物的活动情况。据研究，BaPS法在测量通气良好的土壤时与同位素示踪法同样准确[26]。该方法不需要添加任何物质，便可以较好地反映土壤真实的硝化、反硝化和呼吸作用。但该方法建立在一系列假设之上，这些假设并不在任何条件下都成立，而且其对系统做了过多的简化，因此，应用气压过程分离方法区分硝化作用和反硝化作用对N2O排放贡献率的研究报道并不多。

2 土壤N2O产生途径及其影响因素

2.1 硝化作用及关键微生物

硝化作用一般由氨氧化菌和亚硝酸盐氧化菌共同完成，主要分两个阶段：第一个阶段是在氨氧化细菌（ammonia-oxidizing bacteria, AOB）和氨氧化古菌（ammonia-oxidizingarchaea, AOA）的A基因产生的氨单加氧酶作用下，将氨（NH3）氧化成羟胺（NH2OH），之后在羟胺氧化还原酶的作用下进一步氧化成NO2−的过程，其中氨单加氧酶是硝化反应的限速步骤。第二个阶段是由亚硝酸盐氧化菌的基因主导的亚硝酸盐氧化还原酶催化下发生的亚硝化反应，将NO2−进一步氧化成NO3−。其过程如图1所示。

①氨单加氧酶Ammonia monooxygenase （AMO）②羟氨氧化还原酶Hydroxylamine oxidoreductase（HAO）③亚硝酸盐氧化还原酶Nitrite oxidoreductase（NOR）④硝酸盐还原酶Nitrate reductase（Nar）⑤亚硝酸盐还原酶（e−1）Nitrite reductase（Nir）⑥一氧化氮还原酶Nitric oxide reductase（Nor）⑦氧化亚氮还原酶Nitrous oxide reductase（Nos）⑧亚硝酸盐还原酶（6e−）Nitrite reductase（Nir）

在硝化过程中，中间产物NH2OH或NO2−会发生化学分解或不完全氧化释放出N2O[28-29]。有研究发现，亚硝化单胞菌（Nitrosomonas）的细胞色素（cyt，p460）酶可在缺乏氧气条件下将NH2OH定量转化为N2O[30]。还有研究发现，硝化螺菌属的某种“完全硝化菌”可将NH3直接氧化为NO3−，该菌种具有编码氨氧化和亚硝酸盐氧化两个过程的功能基因[31]。氨氧化过程被认为是硝化作用的限速步骤，在AOA发现前，氨氧化过程一直被认为主要由AOB进行。对土壤中氨氧化菌的研究通常利用和A两个基因，这两个基因的相对丰度代表了AOB在土壤微生物群落结构中的分布水平。对AOB的基因序列的研究表明，AOB主要分为变形杆菌纲β亚群和γ亚群的亚硝化球菌属[32]。土壤生态系统的AOB主要源于β亚纲中的亚硝化单胞菌（）和亚硝化螺菌（）两个属，包含了9个不同的种群，广泛分布于陆地生态系统中。而目前发现的氨氧化古菌主要为泉古菌类（），由于AOA存在太多未知菌种，分离培养困难，关于AOA的认知还处于起步阶段。有研究发现，AOA在中国酸性红壤中是优势菌群，其丰度与土壤硝化速率呈现出显著正相关关系[33]。另有研究表明，碱性潮土中AOA丰度虽然大于AOB，但是只有AOB丰度与硝化速率显著相关并随施肥处理发生改变[34]。上述研究表明，土壤中AOB和AOA可能在不同的土壤环境中起主导作用，AOA更容易适应酸性且养分低的土壤，并在硝化过程中起主导作用，而AOB更适合在中碱性土壤中生存并进行硝化作用。对AOA和AOB的研究表明，在大部分土壤中AOA的相对丰度比AOB高，但在营养丰富的特殊环境中，AOB的相对丰度要高于AOA[35-36]，二者氨氧化过程的区别有待深入研究。

硝化作用分为自养硝化作用和异养硝化作用两种类型，其中自养硝化微生物可以利用CO2作为碳源，将NH3氧化成硝酸盐并获得能量用于细胞生长；而异养硝化微生物必须利用有机碳获得能量才能将不同形态的氮元素氧化为硝酸盐和亚硝酸盐[37-38]。有研究利用乙炔抑制法进行实验证明硝化作用是以自养微生物的作用为主，异养微生物为辅[39]，但是有研究表明异养硝化微生物在特定的条件如好氧环境下会产生大量的N2O，并远高于自养硝化作用[40]。目前，硝化作用的测定实验中一般以亚硝酸盐和硝酸盐以及产生气体的量来确定，由于硝化反硝化作用的同时存在会使以上产物消耗，导致测定结果不准确[41]。关于异养硝化作用在好氧条件下的反应机制仍不明确，有待进一步研究。

2.2 反硝化作用及关键微生物

反硝化作用即脱氮作用，是影响全球氮循环的重要环节，反硝化作用不仅造成氮肥的损失，又被认为是土壤产生N2O的主要途径之一。反硝化作用在缺少氧气的条件下进行，分为4步：（1）NO3−在基因编码的硝酸盐还原酶的作用下还原为NO2−；（2）NO2−在基因编码的亚硝酸盐还原酶的作用下还原为NO；（3）NO在基因编码的NO还原酶的作用下还原为N2O；（4）N2O在基因编码的N2O还原酶的作用下还原为无害的N2[40]。其中氮以NO、N2O、N2的形式释放出来，造成了农田土壤氮素的流失。

反硝化过程由占土壤总细菌数量0.1%～5.0%的兼性厌氧细菌主导。有研究采用15N同位素标记法测得在60％的土壤孔隙（water-filled pore space；WFPS）充水时，反硝化作用为N2O的主要来源[41]。说明在常规水分条件的土壤中，反硝化作用主导了N2O排放。N2O还原酶活性会受到氧气的暂时抑制，隔离氧气后，N2O还原酶会在0.7～3h内恢复。反硝化微生物广泛分布于假单胞菌（）、芽孢杆菌（）、盐杆菌（）、根瘤菌（）、红螺菌（）、脱氮副球菌（）、嗜纤维菌（）等细菌种属，除此之外，有研究发现真菌也可以参与反硝化作用，在特定的生态系统中参与反硝化作用的还有古菌以及放线菌[42]，因此，对农田生态系统反硝化作用的研究也应该将细菌以外的微生物考虑在内。目前，对反硝化作用有关的功能基因（G，A，K，S，B和Z）的研究已经有了大量的应用[43-44]。N2O排放量与K、S和Z等具有显著相关性，并且反硝化菌中存在缺失Z基因的种类，这类反硝化菌不能产生N2O还原酶，进行反硝化作用是不完全的，N2O直接被释放出来并且不会还原成N2[45]。此外，某些硝化微生物可以发生反硝化作用产生N2O，这些硝化微生物的反硝化作用通常在低氧环境中发生，首先将NH3氧化成NO2−，然后将NO2−还原成N2O或N2[27]。研究表明，硝化微生物的反硝化作用可能是潜在的N2O生成来源，并且对反硝化作用具有一定的贡献[45]。

国内外关于反硝化作用对N2O的贡献已有大量研究，但参与反硝化作用的微生物种类繁多，并且多数微生物的作用机理和基因序列是未知的[46]。今后应加强分子生物学技术在反硝化作用研究中的应用，并对N2O排放相关的反硝化微生物种类进行区分，加强对相关功能基因的准确鉴定。

2.3 土壤N2O产生的其它途径

硝化与反硝化作用是自然界中氮素循环的主要驱动力，释放了占土壤总释放量约70%的N2O。除此之外，硝酸盐异化还原成铵（DNRA）以及“共同反硝化”作用等也会产生N2O。

DNRA作用是指NO3−在厌氧条件下被微生物异化还原成NH4+的过程[47]。DNRA过程分为两步反应，首先在硝酸盐还原酶的作用下，将NO3−还原成NO2−；然后在亚硝酸还原酶的催化下将NO2−转化为NH4+。DNRA过程不但将NO3−转化为NH4+，还产生了N2O[27]。在对专性厌氧细菌、兼性厌氧细菌、好氧细菌和真菌等的研究中都发现了DNRA过程[48]。研究表明[49-50]，农田土壤中反硝化作用是NO3−异化还原的主要过程，在草地、森林等高碳氮比的土壤环境中，DNRA对氮素转化以及N2O排放具有重大作用。

近年来，研究发现在草地、森林等土壤环境中，许多真菌能将NO2−与氮化合物中的氮原子结合产生N2O，该过程与一般的反硝化作用不同，被称为“共同反硝化”，但共同反硝化对N2O排放的作用机理至今还有许多未知[51]。章伟等研究表明，真菌在酸性森林土壤中活性是细菌的2倍[38]，并且真菌进行的硝化反硝化作用产生了与细菌等量甚至更多的N2O[52-53]。Herold等[54]研究表明，真菌的反硝化作用贡献显著，并且真菌的生物量在不同梯度土壤中较稳定，因此，对N2O排放量的计算不能忽略真菌的作用[39]。而关于真菌在农田土壤氮循环中的作用以及真菌的硝化反硝化作用对农田土壤N2O排放还需要进一步研究。

此前研究多将N2O排放的贡献来源简单区分为硝化作用和反硝化作用，且由于研究手段有限，不能很好地区分这两种作用对N2O排放的贡献，使硝化作用和反硝化作用的贡献常常被高估或者低估，导致对农田土壤N2O排放机理理解不够全面，在今后的研究工作中还需要探索新的试验方法，深入研究农田土壤中不同微生物利用氮素的不同过程以及N2O的产生机制及其排放贡献。

3 生物炭对土壤N2O产生途径的影响

3.1 生物炭对硝化作用的影响

土壤的硝化作用受土壤类型、通气条件、含水量、温度、土壤pH和底物氮浓度等多因素的影响，土壤中添加生物炭有可能通过改变土壤性状使与N2O产生相关的硝化菌群的生存环境发生改变，从而对硝化作用产生N2O过程起到促进或抑制作用。研究表明，在土壤中添加生物炭后提高了土壤pH值[55-56]，而pH的提高对AOA（氨氧化细菌）和AOB（氨氧化古菌）的生长繁殖会有一定影响，从而影响硝化作用。Ball等[57]研究认为，在酸性林地土壤中添加生物炭后，AOB菌群数量明显提高，土壤中硝化速率也明显提高。Taketani等[58]研究表明，在施用生物炭的土壤中，AOA的多样性降低，但是拷贝数显著提高，而AOB的多样性和基因拷贝数则均明显提高。由于生物炭的表面多孔，能够吸附并储存水和养分，这样可以为土壤微生物特别是细菌提供良好的栖息条件，从而提高AOB和AOA等菌群的丰度，使相应的土壤硝化过程加快[59-60]。但研究结果也不尽一致，如He等[61]研究发现，生物炭对AOA基因拷贝数的影响很小或表现为降低，这种丰度差异多为pH导致的，AOA在酸性条件下更能发挥主导作用。N2O的产生没有增加，反而下降，可能的原因是生物炭的吸附作用固定了一部分N2O。另外，Kookana研究认为，某些酚类化合物会抑制硝化细菌的生长[62]，因此，当土壤中加入生物炭后，酚类化合物被生物炭吸附使其在土壤中的浓度下降，从而减少了酚类化合物对硝化作用造成负面影响的机会，对土壤微生物硝化过程具有强化作用[63]。还有研究认为，生物炭可通过吸附底物来降低微生物的活性，并影响异养微生物如AOB的活性，所以当NH4+被吸附或固定后，土壤中的氨化作用下降从而也抑制了微生物的硝化作用[64]。Yoo等[65]在水稻土壤中添加生物炭发现，土壤中微生物量碳增加了84%～119%，N2O排放明显增加，说明生物炭通过调节土壤理化性质提高了微生物的代谢效率，刺激了硝化作用产生N2O。

总之，目前针对生物炭减少硝化作用N2O排放的研究主要集中在添加生物炭后土壤理化性质的改变[66]以及硝化作用相关功能基因丰度变化等方面，有关生物炭对土壤硝化作用产生N2O的响应仍存在争议，还缺乏影响机理方面的研究。

3.2 生物炭对反硝化作用的影响

反硝化作用不仅造成氮肥的损失，又被认为是土壤产生N2O的主要途径。近年来，关于生物炭施入土壤后能够降低N2O排放这一结果，引起了科研人员的高度重视[67]。研究表明，在农田土壤中添加生物炭可以改善土壤通气状况，并抑制厌氧反硝化微生物的反硝化作用，使N2O排放减少[68]。但也有研究认为，施用生物炭后，土壤N2O排放反而增加[69]。

生物炭对反硝化作用的影响主要有以下几种解释：（1）生物炭改变了土壤理化性质。生物炭C/N比较高，并且结构多孔，在土壤中有利于气体流通，抑制了土壤微生物反硝化作用，降低了N2O排放[70]。（2）生物炭减少了反硝化菌活动。在氮素缺乏、有机质较低的土壤中添加生物炭后，会明显降低土壤中硝态氮与有机质的含量，从而导致反硝化菌活动减少，N2O释放受到抑制[71]。（3）生物炭可以诱发氮素的固定。研究发现，生物炭制作温度越高，水稻土N2O释放量有逐渐减少的趋势，可能原因是诱发氮素固定，由此减少了N2O的排放[72]。（4）生物炭的吸附作用。生物炭颗粒不仅可以吸附游离的NH4+，还能减少土壤中的游离NO3−，从而抑制反硝化作用中N2O的释放[73]。（5）土壤中固氮微生物数量的增加。生物炭的施入，使固氮微生物的数量增加，导致氮的反硝化作用减少，从而起到了降低N2O排放的作用[74]。

Harter等发现，在轻微碱性砂质土壤中，尽管生物炭添加刺激了反硝化基因表达，增加了反硝化作用，但N2O排放也随之减少了，这是因为生物炭对水分饱和情况下土壤孔隙中的N2O进行了吸附，从而刺激了Z编码的细菌N2O还原酶活性和其它N2O还原剂对N2O的还原[75]。调查土壤生物炭施用是否影响携带典型和非典型的Z基因的微生物群落的组成有助于解释该现象[76]。研究表明，Z的表达水平是决定N2O是否被还原成无害的N2的关键因素[77]。Cayuela等[78]研究发现，生物炭在15种不同农业土壤中普遍降低了N2O/(N2O+N2)比例，说明生物炭刺激了反硝化最后一步反应将N2O还原为N2。与之相比，Ameloot等[79]在生物炭是否能够促进土壤反硝化作用的研究中，并未观察到N2O/(N2O+N2)比例降低，即生物炭不能促进N2O还原为N2，可能原因是该土壤中缺少含有N2O还原酶基因的反硝化菌[80]。

4 问题和展望

区分硝化作用与反硝化作用对产生N2O的贡献的方法有多种，其中同位素标记法结合乙炔抑制技术能够对自养硝化作用、异养硝化作用和反硝化作用进行区分，是目前研究硝化反硝化作用对N2O产生贡献，以及探明生物炭对硝化反硝化作用响应机理的最精确的实验方法。

目前对硝化反硝化作用产生N2O机理的研究还不够完善，在不同的实验条件下得到的结果也不尽相同，对农田土壤N2O排放的研究存在局限性和地域性，还需进一步研究如何减少农田温室气体排放、土壤氮素损失等带来的环境风险，促进农业可持续发展。

生物炭对土壤硝化反硝化作用表现出极大的复杂性，有研究表明其通过吸附作用起到的减排作用存在上限[81]。Verhoeven等[82]研究表明，生物炭提高土壤pH，但并未影响N2O的排放。亦有研究表明，富含铁的生物炭能够刺激硝酸盐、亚硝酸盐、N2O的非生物转化[83]。众多研究得出不同甚至相反的结论，说明生物炭应用仍有争议。现有研究对土壤硝化反硝化过程的微生物丰度、群落结构以及N2O排放的微生物学机制仍然缺乏了解。

有研究认为，生物炭对氮循环和N2O的减排作用可能是偶然的，不能起到长期作用[84]。生物炭虽然改变氮循环、土壤理化性质及微生物群落结构，但对N2O减排只有微小且短暂作用，这或许与生物炭的材质有关，不同材质生物炭和各种类型土壤组合存在着特异性，对生物炭特性及其与土壤相互作用机理认知的不完整，阻止了生物炭的发展[85]，未来应从以下方面加强对生物炭的研究：生物炭各种理化性质如表面积、粒径、孔隙度、阳离子交换能力等；生物炭的生产条件如生物炭的原料、生产温度、热解气压、营养物质及有机物含量等；生物炭与土壤环境的搭配性如气候条件、耕作条件和作物种类等[86-88]。还应继续在各领域开发生物炭的利用价值，以利于其推广使用。

随着科技的不断发展，各学科的交叉融合是当今科学研究的重要手段。分子生物学技术的广泛应用与基因组测序的普及，极大地提高了人们对土壤微生物的认知，越来越多的功能基因的发现也对微观机理的认知提供了很好的研究机遇。在未来的研究中，对现有研究技术的改进，以及新研究技术的开发利用将有助于完善土壤硝化反硝化微生物研究的理论体系。生物炭的减排机制研究还存在很多不可控因素，表现出多种不同的研究结果，后续研究应该利用长期定位实验，以及在不易受干扰的系统中进行微观实验等多种实验手段，研究土壤硝化和反硝化对生物炭施用的响应机理。

[1] IPCC.Climate change 2013:the physical science basis[R]. Cambridge,USA:Cambridge University Press,2013.

[2] Hu M,Chen D,Dahlgren R A.Modeling nitrous oxide emission from rivers:a global assessment[J].Global Change Biology, 2016,22(11):3566-3582.

[3] Meng Q,Yue S,Peng H,et al.Improving yield and nitrogen use efficiency simultaneously for maize and wheat in China:a review[J].Pedosphere,2016,26(2):137-147.

[4] Case S D C,Mcnamara N P,Reay D S,et al.Biochar suppresses N2O emissions while maintaining N availability in a sandy loam soil[J].Soil Biology and Biochemistry,2015,81:178-185.

[5] Lehmann J D,Joseph S.Biochar for environmental management[J]. Science and Technology,Earthscan,2015,25(1):15801-15811.

[6] Clough T J,Condron L M,Kammann C,et al.A review of biochar and soil nitrogen dynamics[J].Agronomy,2013,3(2): 275-293.

[7] 孟梦,吕成文,李玉娥,等.添加生物炭对华南早稻田CH4和N2O排放的影响[J].中国农业气象,2013,34(4):396-402.

Meng M,Lv C W,Li Y E,et al.Effect of biochar on CH4and N2O emissions from early rice field in South China[J]. Chinese Journal of Agrometeorology,2013,34(4):396-402.(in Chinese)

[8] 张星,张晴雯,刘杏认,等.施用生物炭对农田土壤氮素转化关键过程的影响[J].中国农业气象,2015,36(6):709-716.

Zhang X,Zhang Q W,Liu X R,et al.Effects of biochar on the key soil nitrogen transformation processes in agricultural soil[J]. Chinese Journal of Agrometeorology,2015,36(6):709-716. (in Chinese)

[9] 韩雪,范靖尉,白晋华,等.减氮和施生物炭对华北夏玉米-冬小麦田土壤CO2和N2O排放的影响[J].中国农业气象,2016, 17(2):2800-2808.

Han X,Fan J W,Bai J H,et al.Effects of reducing nitrogen and biochar application on CO2and N2O emissions from summer maize-winter wheat field in North China[J].Chinese Journal of Agrometeorology,2016,17(2):2800-2808.(in Chinese)

[10] Cayuela M L,Jeffery S,Zwieten L V.The molar H:corg ratio of biochar is a key factor in mitigating N2O emissions from soil[J].Agriculture,Ecosystems and Environment,2015,202 (135-138):135-138.

[11] Yi Q,Tang S,Fan X,et al.Effects of nitrogen application rate,nitrogen synergist and biochar on nitrous oxide emissions from vegetable field in south China[J].PloS ONE,2017,12(4):e0175325.

[12] Cayuela M L,Zwieten L V,Singh B P,et al.Biochar's role in mitigating soil nitrous oxide emissions:a review and meta- analysis[J].Agriculture,Ecosystems and Environment,2014, 191: 5-16.

[13] Chen C R,Phillips I R,Goloran L M,et al.Impacts of greenwaste biochar on ammonia volatilisation from bauxite processing residue sand[J].Plant and Soil,2013,367(1-2): 301-312.

[14] Dai H N,Scheer C,Rowlings D W,et al.Rice husk biochar and crop residue amendment in subtropical cropping soils:effect on biomass production, nitrogen use efficiency and greenhouse gas emissions[J].Biology and Fertility of Soils,2016,52(2):261-270.

[15] 黄树辉,吕军.区分土壤中硝化与反硝化对N2O产生贡献的方法[J].农业工程学报,2005,21(s1):48-51.

Huang S H,Lv J.Methods for the contributions of nitrification and denitrification to the production of nitrous oxide from soil[J].Transactions of the CSAE,2005,21(s1):48-51.(in Chinese)

[16] Webster F A,Hopkins D W.Contributions from different microbial processes to N2O emission from soil under different moisture regimes[J].Biology and Fertility of Soils,1996, 22(4): 331-335.

[17] Wrage N,Velthof G L,Oenema O,et al.Acetylene and oxygen as inhibitors of nitrous oxide production inand:a cautionary tale[J]. Fems Microbiology Ecology,2004,47(1):13-18.

[18] 阎宏亮,张璇,谢立勇,等.菜地土壤施用铵态氮肥后N2O排放来源及其动态[J].中国农业气象,2014,35(2):141-148.

Yan H L,Zhang X,Xie L Y,et al.Study on the pathway and dynamics of N2O emissions from the vegetable soil fertilized with ammonium nitrogen[J].Chinese Journal of Agrometeorology,2014,35(2):141-148.(in Chinese)

[19] Ryden J C,Dawson K P.Evaluation of the acetylene-inhibition technique for the measurement of denitrification in grassland soils[J].Journal of the Science of Food & Agriculture,2010, 33(12):1197-1206.(in Chinese)

[20] Felber R,Conen F,Flechard C R,et al.Theoretical and practical limitations of the acetylene inhibition technique to determine total denitrification losses[J].Biogeosciences,2012, 9(10):4125-4138.

[21] Kool D M,Wrage N,Zechmeisterboltenstern S,et al.Nitrifier denitrification can be a source of N2O from soil: a revised approach to the dual-isotope labelling method[J].European Journal of Soil Science,2010,61(5):759-772.

[22] Pedersen H,Dunkin K A,Firestone M K.The relative importance of autotrophic and heterotrophic nitrification in a conifer forest soil as measured by15N tracer and pool dilution techniques[J].Biogeochemistry,1999,44(2):135-150.

[23] Li W,Sun Y,Li G,et al.Contributions of nitrification and denitrification to N2O emissions from aged refuse bioreactor at different feeding loads of ammonia substrates[J].Waste Management,2017,68:319-328.

[24] Zhang Z,Wang J J,Lu X.Fingerprint natural soil N2O emission from nitration and denitrification by dual isotopes (15N and18O) and site preferences[J].Acta Ecologica Sinica, 2016,36(5):356-360.

[25] 付素静.干旱荒漠区典型土壤硝酸盐分布特征及硝化反硝化作用研究[D].兰州:兰州大学,2012.

Fu S J.Nitrate distribution and nitrification-denitrification in the soils of desert areas,Northwest China[D].Lanzhou: Lanzhou University,2012.(in Chinese)

[26] Frame C H,Casciotti K L.Biogeochemical controls and isotopic signatures of nitrous oxide production by a marine ammonia-oxidizing bacterium[J].Biogeosciences,2010,7(2): 2695-2709.

[27] 朱永官,王晓辉,杨小茹,等.农田土壤N2O产生的关键微生物过程及减排措施[J].环境科学,2014,35(2):792-800.

Zhu Y G,Wang X H,Yang X R,et al.Key microbial processes in nitrous oxide emissions of agricultural soil and mitigation strategies[J].Environmental Science,2014,35(2):792-800.(in Chinese)

[28] Wrage N,van Groenigen J W,Oenema O,et al.A novel dual-isotope labelling method for distinguishing between soil sources of N2O[J].Rapid Communications in Mass Spectrometry Rcm,2005,19(22):3298-3306.

[29] Caranto J D,Vilbert A C,Lancaster K M.P460 is a direct link between nitrification and nitrous oxide emission[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2016, 113(51):14704-14709.

[30] Daims H,Lebedeva E V,Pjevac P,et al.Complete nitrification by nitrospira bacteria[J].Nature,2015,528:504-509.

[31] Laughlin R J,RüTting T,MüLler C,et al.Effect of acetate on soil respiration,N2O emissions and gross N transformations related to fungi and bacteria in a grassland soil[J].Applied Soil Ecology,2009,42(1):25-30.

[32] Shen J P,Zhang L M,Zhu Y G,et al.Abundance and composition of ammonia-oxidizing bacteria and ammonia- oxidizing archaea communities of an alkaline sandy loam[J].Environmental Microbiology,2008,10(6):1601-1611.

[33] Mertens J,Broos K,Wakelin S A,et al.Bacteria,not archaea, restore nitrification in a zinc-contaminated soil[J].The ISME Journal,2009,3(8):916-923.

[34] Di H J,Cameron K C,Shen J P,et al.Nitrification driven by bacteria and not archaea in nitrogen-rich grassland soils[J].Nature Geoscience,2009,2(9):621-624.

[35] Papen H, Berg R V.A Most Probable Number method (MPN) for the estimation of cell numbers of heterotrophic nitrifying bacteria in soil[J].Plant and Soil,1998,199(1):123-130.

[36] Richardson D J,Wehrfritz J M,Keech A,et al.The diversity of redox proteins involved in bacterial heterotrophic nitrification and aerobic denitrification[J].Biochemical Society Transactions, 1998,26(3):401-8.

[37] Marusenko Y,Huber D P,Hall S J.Fungi mediate nitrous oxide production but not ammonia oxidation in arid land soils of the southwestern US[J].Soil Biology and Biochemistry, 2013,63(4):24-36.

[38] 章伟,高人,陈仕东,等.米槠天然林土壤真菌对N2O产生的贡献[J].亚热带资源与环境学报,2013,8(2):28-34.

Zhang W,Gao R,Chen S D,et al.Fungal contribution to N2O production in soil for a natural Castanopsis carlesii forest in Wuyi nature reserve,Southeastern[J].China Journal of Subtropical Resources and Environment,2013,8(2):28-34.(in Chinese)

[39] 黄莹,龙锡恩.真菌对土壤N2O释放的贡献及其研究方法[J].应用生态学报,2014,25(4):1213-1220.

Huang Y,Long X E.Contribution of fungi to soil nitrous oxide emission and their research methods:a review[J].Chinese Journal of Applied Ecology,2014,25(4):1213-1220.(in Chinese)

[40] Zhang Q,Li F,Tang C.Quantifying of soil denitrification potential in a wetland ecosystem,ochi experiment site,Japan[J]. Journal of Resources and Ecology,2012,3(1):93-96.

[41] Shoun H.Denitrification and anaerobic energy producing mechanisms by fungi[J].Tanpakushitsu Kakusan Koso Protein Nucleic Acid Enzyme,2006,51(5):419-29.

[42] Zhe C,Luo X,Hu R,et al.Impact of long-term fertilization on the composition of denitrifier communities based on nitrite reductase analyses in a paddy soil[J].Microbial Ecology, 2010, 60(4):850-861.

[43] Liu J, Hou H, Sheng R, et al. Denitrifying communities differentially respond to flooding drying cycles in paddy soils[J].Applied Soil Ecology,2012,62(62):155-162.

[44] Bakken L R,Åsa Frostegård.Regulation of denitrification at the cellular level:a clue to the understanding of N2O emissions from soils[J].Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences,2012,367(1593):1226-34.

[45] Shaw L J,Nicol G W,Smith Z,et al.spp.can produce nitrous oxide via a nitrifier denitrification pathway [J].Environmental Microbiology, 2006, 8(2):214-222.

[46] Kandeler E,Deiglmayr K,Tscherko D,et al.Abundance of,,,andgenes of denitrifying bacteria during primary successions of a glacier foreland[J].Applied and Environmental Microbiology,2006,72(9):5957-5962.

[47] Baggs E M.A review of stable isotope techniques for N2O source partitioning in soils:recent progress, remaining challenges and future considerations[J].Rapid Communications in Mass Spectrometry,2010,22(11):1664-1672.

[48] Yin S X,Chen D,Chen L M,et al.Dissimilatory nitrate reduction to ammonium and responsible microorganisms in two Chinese and Australian paddy soils[J].Soil Biology and Biochemistry,2002, 34(8):1131-1137.

[49] Schmidt C S,Richardson D J,Baggs E M.Constraining the conditions conducive to dissimilatory nitrate reduction to ammonium in temperate arable soils[J].Soil Biology and Biochemistry,2011,43(7):1607-1611.

[50] Rütting T,Boeckx P,Müller C,et al.Assessment of the importance of dissimilatory nitrate reduction to ammonium for the terrestrial nitrogen cycle[J].Biogeosciences,2011, 8(7):1779-1791.

[51] Baggs E M.Soil microbial sources of nitrous oxide:recent advances in knowledge, emerging challenges and future direction[J].Current Opinion in Environmental Sustainability, 2011,3(5):321-327.

[52] Wu Y P,Ma B,Zhou L,et al.Changes in the soil microbial community structure with latitude in eastern China,based on phospholipid fatty acid analysis[J].Applied Soil Ecology,2009, 43(2):234-240.

[53] Spott O,Russow R,Stange C F.Formation of hybrid N2O and hybrid N2due to codenitrification:first review of a barely considered process of microbially mediated N-nitrosation[J]. Soil Biology and Biochemistry,2011,43(10):1995-2011.

[54] Herold M B,Baggs E M,Daniell T J.Fungal and bacterial denitrification are differently affected by long-term pH amendment and cultivation of arable soil[J].Soil Biology and Biochemistry,2012,54(6):25-35.

[55] Masulili A,Utomo W H,Syechfani M S.Rice husk biochar for rice based cropping system in acid soil I:the characteristics of rice husk biochar and its influence on the properties of acid sulfate soils and rice growth in west Kalimantan,Indonesia [J]. Journal of Agricultural Science, 2010,2(1):39-47.

[56] 张星,刘杏认,林国林,等.生物炭和秸秆对华北农田表层土壤矿质氮和pH值的影响[J].中国农业气象,2016,37(2): 131-142.

Zhang X,Liu X R,Lin G L,et al.Effects of biochar and straw return on mineral nitrogen and pH of the surface soil in farmland of the North China Plain[J].Chinese Journal of Agrometeorology,2016,37(2):131-142.(in Chinese)

[57] Ball P N,Mackenzie M D,Deluca T H,et al.Wildfire and charcoal enhance nitrification and ammonium-oxidizing bacterial abundance in dry montane forest soils[J].Journal of Environmental Quality,2010,39(4):1243-1253.

[58] Taketani R G,Tsai S M.The influence of different land uses on the structure of archaeal communities in Amazonian anthrosols based on 16S rRNA and amoA genes[J]. Microbial Ecology,2010,59(4):734-743.

[59] Steinbeiss S,Gleixner G,Antonietti M.Effect of biochar amendment on soil carbon balance and soil microbial active- ity [J]. Soil Biology and Biochemistry,2009,41(6):1301-1310.

[60] Deluca T H,MacKenzie M D,Gundale M J,et al.Biochar effects on soil nutrient transformations[A].Biochar for environmental management: science and technology[C].London,UK: Earthscan, 2009: 251-270.

[61] He L,Zhao X,Wang S,et al.The effects of rice-straw biochar addition on nitrification activity and nitrous oxide emissions in two oxisols[J].Soil and Tillage Research,2016,164:52-62.

[62] Kookana R S,Sarmah A K,Zwieten L V,et al.Biochar application to soil: agronomic and environmental benefits and unintended consequences[J].Advances in Agronomy, 2011,112:103-143.

[63] Gundale M J,Deluca T H.Temperature and source material influence ecological attributes of ponderosa pine and Douglas-fir charcoal[J].Forest Ecology and Management, 2006,231(1):86-93.

[64] Strauss E A,Lamberti G A.Regulation of nitrification in aquatic sediments by organic carbon[J].Limnology and Oceanography,2000,45(8):1854-1859.

[65] Yoo G,You J K,Yong O L,et al.Investigation of greenhouse gas emissions from the soil amended with rice straw biochar[J]. Ksce Journal of Civil Engineering,2016,20(6): 2197-2207.

[66] Gul S,Whalen J K,Thomas B W,et al.Physico-chemical properties and microbial responses in biochar-amended soils:mechanisms and future directions[J].Agriculture, Ecosystems and Environment,2015,206:46-59.

[67] Sánchez-García M,Roig A,Sanchez-Monedero M A,et al.Biochar increases soil N2O emissions produced by nitrification-mediated pathways[J].Frontiers in Environmental Science,2014,2(2):1-10.

[68] Singh B P,Hatton B J,Balwant S,et al.Influence of biochars on nitrous oxide emission and nitrogen leaching from two contrasting soils[J].Journal of Environmental Quality,2010, 39(4):1224-1235.

[69] Karhu K,Mattila T,Bergström I,et al.Biochar addition to agricultural soil increased CH4uptake and water holding capacity-results from a short-term pilot field study[J].Agriculture, Ecosystems and Environment,2011,140(1-2):309-313.

[70] Lehmann J,Gaunt J,Rondon M,et al.Biochar sequestration in terrestrial ecosystems-a review[J].Mitigation & Adaptation Strategies for Global Change,2006,11(2):395-419.

[71] 颜永毫,王丹丹,郑纪勇.生物炭对土壤N2O和CH4排放影响的研究进展[J].中国农学通报,2013,29(8):140-146.

Yan Y H,Wang D D,Zheng J Y,et al.Advances in effects of biochar on the soil N2O and CH4emissions[J].Chinese Agricultural Science Bulletin,2013,29(8):140-146.(in Chinese)

[72] Wang J,Pan X,Liu Y,et al.Effects of biochar amendment in two soils on greenhouse gas emissions and crop production [J].Plant and Soil,2012,360(1-2):287-298.

[73] Cayuela M L,Oenema O,Kuikman P J,et al.Bioenergy by-products as soil amendments? implications for carbon sequestration and greenhouse gas emissions[J].GCB Bioenergy, 2010,2 (4):201-213.

[74] Deluca T H,Aplet G H.Charcoal and carbon storage in forest soils of the rocky mountain west[J].Frontiers in Ecology and the Environment,2008,6(1):18-24.

[75] Harter J,Guzmanbustamante I,Kuehfuss S,et al.Gas entrapment and microbial N2O reduction reduce N2O emissions from a biochar-amended sandy clay loam soil[J].Scientific Reports, 2016,6:39574.

[76] Harter J,Weigold P,El-Hadidi M,et al.Soil biochar amendment shapes the composition of N2O-reducing microbial communities[J].Science of the Total Environment,2016,562: 379-390.

[77] Thomson A J,Giannopoulos G,Pretty J,et al.Biological sources and sinks of nitrous oxide and strategies to mitigate emissions[J].Philosophical Transactions of the Royal Society of London,2012,367(1593):1157-1168.

[78] Cayuela M L,Sánchezmonedero M A,Roig A,et al.Biochar and denitrification in soils:when,how much and why does biochar reduce N2O emissions [J].Scientific Reports,2013, 3:1732.

[79] Ameloot N,Maenhout P,Neve S D,et al.Biochar-induced N2O emission reductions after field incorporation in a loam soil[J].Geoderma,2016,267:10-16.

[80] Lin X,Spokas K A,Venterea R T,et al.Assessing microbial contributions to N2O impacts following biochar additions[J]. Agronomy,2014,4(4):478-496.

[81] Yao Y,Gao B,Zhang M,et al.Effect of biochar amendment on sorption and leaching of nitrate,ammonium, and phosphate in a sandy soil[J].Chemosphere,2012,89(11):1467-71.

[82] Verhoeven E,Six J.Biochar does not mitigate field-scale N2O emissions in a northern California vineyard:an assessment across two years[J].Agriculture,Ecosystems and Environment, 2014,191(15):27-38.

[83] Li X.Evidence for denitrification as main source of N2O emission from residue-amended soil[J].Soil Biology and Biochemistry,2016,92:153-160.

[84] Pereira E I P,Suddick E C,Mansour I,et al.Biochar alters nitrogen transformations but has minimal effects on nitrous oxide emissions in an organically managed lettuce mesocosm[J].Biology and Fertility of Soils,2015,51(5): 573-582.

[85] Sigua G C,Novak J M,Watts D W,et al.Carbon mineral- ization in two ultisols amended with different sources and particle sizes of pyrolyzed biochar[J].Chemosphere, 2014, 103(5):313-321.

[86] Nguyen T T N,Xu C Y,Tahmasbian I,et al.Effects of biochar on soil available inorganic nitrogen:a review and meta- analysis[J].Geoderma,2017,288:79-96.

[87] Janus A,Pelfrêne A,Heymans S,et al.Elaboration, characteristics and advantages of biochars for the management of contaminated soils with a specific overview on miscanthus biochars[J].Journal of Environmental Management,2015,162: 275-289.

[88] Sima X F,Wang Y Y,Shen X C,et al.Robust biochar-assisted alleviation of membrane fouling in MBRs by indirect mechanism[J].Separation and Purification Technology,2017, 184:195-204.

Nitrification and Denitrification and its Response to Biochar Addition in AgriculturalSoil：A Review

ZHAO Guang-xin1,2, ZHANG Qing-wen2, LIU Xing-ren2, TIAN Xiu-ping1

（1. College of Agronomy and Resource Environment, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China; 2. Institute of Environment and Sustainable Development in Agricultural, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081）

Nitrous oxide (N2O) is one of the most important greenhouse gases, and agriculture soils are the main emission sources. Nitrification and denitrification, which are dominated by microbes, are the most important emission pathways. Therefore, the soil nitrification and denitrification have been paid much attention by scientists. Based on a large quantity of literatures, this paper summarizes the methods of distinguishing the contribution of nitrification and denitrification to N2O emission, soil N2O production pathway and its influencing factors, and mechanism of the effects of biochar on N2O emission. The results showed that the response of nitrification and denitrification to biochar was different, and there was still a lot of uncertainty in the effect of biochar on N2O emission reduction. The underlying mechanism was not yet clear. As such, this paper proposed the best research method to distinguish the contribution of nitrification and denitrification to N2O emission. Finally, the research prospect of the influencing factors of nitrification and denitrification and the response mechanism of biochar in farmland soil were also proposed.

Nitrous oxide; Nitrification inhibitor; Soil microbe; Functional gene

10.3969/j.issn.1000-6362.2018.07.002

赵光昕,张晴雯,刘杏认,等.农田土壤硝化反硝化作用及其对生物炭添加响应的研究进展[J].中国农业气象,2018,39(7):442-452

2017−11−29

。E-mail：liuxr1976@126.com；tian5918@sohu.com

国家水体污染控制与治理科技重大专项（2015ZX07203-007）；国家自然科学基金项目（41773090；31300375）

赵光昕（1991−），硕士生，主要研究方向为农业生态系统碳氮循环。E-mail：zgxzhao@126.com