原玻璃节杆菌Y1对磺胺吡啶抗药性及其生长动力学

熊明华，杨芮，张少飞，纪磊，李峰

(淮北师范大学生命科学学院，安徽 淮北 235000)

抗生素是指由细菌、放线菌、真菌等微生物经培养而获得的或是用化学法合成的结构相同或者类似能够杀灭或抑制病原微生物的物质[1,2]。抗生素在保障人类健康和促进畜牧业发展等方面发挥了重要作用[3]。通过口服或肌肉注射进入动物体内的抗生素只有15%可被吸收利用，大约85%以原药或者代谢产物的形式经由病人、动物的粪尿等方式排出体外直接进入自然环境或者污水处理厂[4,5]。由于现有水处理技术不能有效去除污水中含有的抗生素[6]，这些抗生素最终还是进入土壤、水体等自然环境中。另外，含有各种抗生素的禽畜粪便作为有机肥施用于农田生态系统，导致农田土壤、水体甚至地下水抗生素污染。在Warman等[7]发现鸡粪施肥土壤中存在氯四环素污染后,土壤、沉积物、污泥甚至肥料中各种抗生素相继被检出[8，9]。

磺胺类药物是以对氨基苯磺酰胺为基本化学结构的一类合成抗菌药物，其种类繁多，用于预防和治疗细菌感染性疾病，是重要的人兽共用药物。其中磺胺吡啶、磺胺嘧啶和磺胺甲恶唑是最常用的3种磺胺类抗生素，也是环境中检测最频繁的磺胺类抗生素[10,11]。我国的珠江水域和环渤海水域中也以较高浓度检测到磺胺类抗生素[12,13]。虽然磺胺类抗生素在土壤中的迁移能力较强，但田间研究表明施用于土壤中的胺类抗生素只有一小部分进入周边水体，大部分仍然以不可提取形式残留在土壤中且不易降解[14,15]。Pawelzick等[16]在德国西北部液体粪肥施用后的沙壤中发现了四环素和磺胺甲嘧啶残留，在0～30cm的土层中土霉素、四环素、氯四环素、磺胺甲嘧啶的含量分别达27、443、93、4.5μg/kg。

微生物降解是一种经济、有效的去除包括抗生素在内的环境有机污染物的绿色方法。在使用微生物修复污染环境之前需要考虑的一个重要问题是所用微生物的安全性及其对目标污染物的耐受程度。原玻璃节杆菌Y1是淮北师范大学微生物实验室分离的一株磺胺类抗生素耐药细菌。本研究的主要目的是通过测定该原玻璃节杆菌对磺胺吡啶的最小抑制浓度以及在抗生素压力下该菌的生长动力学，为其风险管理及其工程应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料

磺胺吡啶(Sulfapyridine，SPY)(分析纯,98%)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；培养基配制所需药品购自国药集团化学试剂有限公司；原玻璃节杆菌Y1由淮北师范大学微生物实验室分离保存，E.coliATCC 25922由国家海洋环境监测中心(大连)那广水研究员馈赠。

1.2 菌株Y1最小抑制浓度(MIC)测定

将4℃保藏的原玻璃节杆菌Y1试管斜面接种到LB液体培养基中，置于30℃、160 r/min条件下摇床进行过夜培养，获得菌株Y1菌体培养液。取该菌体培养液离心、无菌水洗涤3次之后，LB液体培养基调整菌悬液浓度约为1.5×108个/mL。取20μL该菌悬液接种到含不同浓度SPY的96孔酶标板孔中，每孔总体积为200μL。同时接种E.coliATCC 25922和不接种(LB液体培养基补齐)进行质控和过程控制。酶标板置于培养箱(TQHZ-2002A型)30℃恒温震荡培养24h后用酶标分析仪(RT-2100C型)测定其光密度D600nm值。菌株Y1和E.coliATCC 25922均不生长的临界浓度定义为SPY对该菌株的MIC。

1.3 最小抑菌浓度的验证

为了检验1.2 所测定的MIC能否完全抑制菌株Y1的生长，取过夜培养的菌株Y1离心、洗涤后，进行10×系列稀释，取100μL适当稀释度菌悬液涂布含有最小抑制浓度(1.2测定)SPY的LB平板，倒置于智能光照培养(PGX-350B型)37℃条件下恒温培养24～48h。观察平板上菌体的生长状况。同时接种一组无抗生素的LB平板作为对照。上述实验均以E.coliATCC 25922作为质控菌株，即含SPY和不含SPY的LB平板同时接种该菌株，在相同条件下进行培养。

1.4 无抗生素压力下菌株Y1生长动力学

按照1.2的方法制备菌株Y1菌悬液，将其菌体浓度调整到D600nm分别为0.1、0.2、0.3。分别取上述浓度的菌体悬液500μL 接种到200mL不含抗生素的LB液体培养基中，在30℃和160r/min条件下摇瓶培养，每小时分别取样3mL于无菌离心管中，放入冰箱冻存，待全部取样完成后统一进行D600nm值测定。根据此D600nm值数据，采用Origin 9.1软件选择SGompertz模型(式1)[17]对菌株Y1的生长情况进行拟合,采用均方误差(Mean Square Error，MSE)和R2对一级模型进行评价。根据拟合得到的模型参数，选用式(1)计算出最大比生长速率(μmax)和式(2)计算出延滞期(λ)。

lg(Nt/N0)=a×exp{-exp[-k×(t-xc)]}

(1)

μmax=a×k/e

(2)

λ=xc-1/k

(3)

式中，N0、Nt分别表示初始时间和在时间t时的微生物量(D600nm)；λ为延滞期，h；a为最大生物量Nmax与初始生物量N0的差值；xc为达到相对最大生长速率所需的时间，h；k为在时间xc的相对生长速率，D600nm/h。

1.5 不同抗生素浓度压力下菌株Y1生长动力学

按照“1.2”的方法制备菌株Y1菌悬液浓度，取D600nm=0.3的菌悬液接种含不同浓度SPY的LB培养基，按照“1.3”的方法培养和测定D600nm值并进行拟合和相关参数的计算。

2 结果与分析

2.1 菌株Y1 MIC的测定

培养24h后，菌株Y1以及质控菌株ATCC 25922在LB培养基中的生长量如表1所示。随着LB培养基中SPY浓度的提高，菌株Y1的生长量(D600nm)逐渐降低，但是质控菌株无生长。当SPY浓度提高到13mg/mL时，菌株Y1的D600nm与质控菌株以及背景D600nm值(CK)相当，表明此浓度是抑制菌株Y1生长的最低浓度，即菌株Y1的MIC值。

表1 MIC测定结果

2.2 菌株Y1 MIC的验证

图1 菌株Y1和ATCC25922在含有和不含SPY(13mg/mL)LB培养基上的生长

菌株Y1和质控菌株ATCC 25922在含有最小抑制浓度(13mg/mL) SPY 和不含SPY LB平板上的生长如图1所示。在不含SPY LB平板上，质控菌株ATCC25922(图1-a1)和菌株Y1(图1-b1)均明显生长，但是在含有最小抑制浓度SPY LB培养基平板没有任何菌落生长(图1-a2和图1-b2)。表明13mg/mL SPY可以抑制菌株Y1的生长。自然环境中抗生素浓度一般在ng/L～mg/L水平，很显然，菌株Y1能够耐受的SPY水平远高于此水平。

2.3 无抗生素压力下菌株Y1生长动力学

选用SGompertz模型,应用Origin 9.1 软件分别拟合不同接种量下菌株Y1的生长曲线(图2)，得到其模型拟合参数(表2)。结果表明，SGompertz 模型能较好地拟合菌株Y1在D600nm为0.1、0.2、0.3的接种量下的生长曲线，其R2分别为0.98874、0.99046和0.97661。MSE用以评价数据的变异程度，MSE值越小，说明预测模型精确度越好。上述3个浓度接种量下菌株Y生长量SGompertz 模型拟合的MSE值分别为0.00775、0.00612和0.01641。

图2 SGompertz模型拟合的菌株Y1在D600nm为0.1(a)、0.2(b)、0.3(c)接种量时的生长曲线

这表明SGompertz 模型的拟合度较高，模型的误差较小。

根据SGompertz模型拟合得到的模型参数计算出的菌株Y1最大比生长速率μmax和迟滞期λ如表2所示。可见，随着初始接种量的增大，菌株Y1的最大比生长速率无显著变化，而迟滞期则呈降低趋势。表明提高接种量可以降低菌体在环境中的延滞期，以助于其在抗逆环境如抗生素污染环境中快速增殖从而定殖发挥修复作用。

表2 无抗生素压力不同接种量菌株Y1一级生长模型拟合参数

2.4 不同浓度SPY压力下菌株Y1生长动力学

SGompertz模型对不同浓度SPY压力下菌株Y1的生长曲线拟合如图3所示。3、6、9mg/mL SPY压力下SGompertz模型菌株Y1生长曲线的R2分别为0.99446、0.99188和0.97318；MSE值分别为0.00368、0.00415和0.00637。表明SGompertz模型对抗生素压力下的菌株Y1的生长也能较好地拟合。根据SGompertz模型拟合得到的模型参数计算出的菌株Y1最大比生长速率μmax和迟滞期λ如表3所示。可见，随着抗生素浓度的增大，菌株Y1的最大比生长速率逐渐减小，而迟滞期也逐渐延长，表明抗生素对菌体Y1的毒害作用随着浓度的增加而加大。但是，当环境中SPY浓度不超过3 mg/mL时，菌株Y1的最大比生长速率以及最大生物量与无抗生素压力下的相应值相当，尽管其延滞期稍有延长，表明该菌株修复3mg/mL以下SPY污染环境具有较大的应用潜力。

图3 SGompertz模型拟合的菌株Y1在3(a)、6(b)、 9mg/mL (c)SPY时的生长曲线

SPY浓度/(mg·mL-1)SGompertz模型拟合系数axckμmaxλR2MSE32.124677.939610.309930.242254.713080.994460.0036862.8702812.440250.147520.155775.661510.991880.0041591.9339313.079190.169150.120345.911910.973180.00637

3 结论

SPY对原玻璃节杆菌Y1的最小抑菌浓度为13mg/mL。SGompertz模型对该菌生长曲线拟合度高，模型误差小。无SPY压力下，随着接种量增大，菌株Y1最大比生长速率(μmax=0.24830～0.29797)和最大生长量(a=2.03441～2.21512)无显著差异，但是延滞期(λ=6.12695～3.11051)减小。当存在SPY时，随着其浓度提高，菌株Y1最大比生长速率(μmax=0.24225～0.12034)以及延滞期(λ=4.71308～5.91191)均显著降低。菌株Y1在3mg/mL SPY与无SPY时的最大比生长速率(μmax=0.24225)和最大生物量(a=2.12467)相当，但其延滞期稍有降低(λ=4.71308)。本研究结果可为原玻璃节杆菌Y1工程应用及其风险管理提供依据。

致谢：本研究所用E.coliATCC 25922为国家海洋环境监测中心(大连)的那广水研究员馈赠，特表谢忱！