太空茄子叶黄酮大孔树脂纯化工艺优化及抗氧化性研究

杨 彬 金小青 李彩霞 焦 扬

(1. 河西学院农业与生物技术学院，甘肃 张掖 734000;2. 甘肃省高校河西走廊特色资源利用省级重点实验室，甘肃 张掖 734000)

茄子(FructussolanμmmelongenaL.)为茄科茄属以浆果为产品的一年生草本植物。原产地印度，在中国已有1 500 多年的栽培历史[1]。太空茄作为其品种之一，产量高、品质好、营养丰富。茄叶作为茄子生产中的下脚料，资源丰富，目前主要被作为饲料或肥料使用，附加值较低。对茄子叶黄酮分离纯化的研究相对较少，仅见莫天录等[2]采用大孔吸附树脂对绿茄叶中黄酮的纯化研究，未见有关太空茄叶的研究报道。

黄酮类化合物是指以色原酮为母核的一大类有机化合物，是植物重要的次级代谢产物，广泛存在于植物的各个器官[3]。研究发现黄酮类化合物具有抗氧化、抗炎[4]、保肝、防止心血管疾病、抗过敏、抗突变[5]、皮肤抗衰老美容等多种生理功能[6]，因而黄酮被称为“第七类营养素”。目前众多学者从天然植物中提取黄酮等活性成分，然而茄子各部位含有许多活性成分[7]，其果实是重要的蔬菜。茄子果实采摘后，用茄子叶提取黄酮并进行分离纯化，补充活性成分资源不足，变废为宝。

大孔树脂是近年发展起来的一类具有多孔立体结构的有机高分子聚合物吸附剂，具有吸附容量大、选择性好、容易解吸、机械强度大、可重复使用等特点[8]，已广泛应用于多酚、生物碱、二氢槲皮素、皂苷等活性成分的分离纯化[9-10]。本试验拟通过对5种不同类型大孔树脂的吸附和解吸性能进行比较，筛选适宜的纯化太空茄叶黄酮的大孔树脂，对其静态吸附、解吸及动态纯化效果进行分析，并测定纯化前后黄酮提取物含量及抗氧化活性，以期为太空茄子叶黄酮深度开发和利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

太空茄子叶片： 河西学院农学试验园采摘；

芦丁标准品：中国药品生物制品鉴定所；

无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝，氢氧化钠等：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

D101、D4020、X-5、AB-8、NAK-Ⅱ树脂：物理属性见表1，天津南开大学化工厂；

双配套循环水式多用真空泵：SHZ-2000型，河南省巩义市英峪予华仪器厂；

分光光度计：Spectrμmlab24型，上海棱光技术有限公司；

表1 吸附树脂的物理性质Table 1 Physical properties of the adsorption resin

数显恒温水浴锅：HH-4型，国华电器有限公司；

电子天平：FA2104型， 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；

层析柱：Φ15 mm×30 mm，上海亚荣生化仪器厂；

旋转蒸发器：RG-2000A型，巩义市京华仪器有限责任公司；

恒温振荡培养箱：HZP-250型，上海精宏实验设备有限公司；

自动核酸蛋白分离层析仪：MC99-2型，上海青浦沪西仪器厂；

冷冻干燥机：Scientz-100F型，宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 黄酮的提取与测定

1.2.1 太空茄叶预处理 太空茄子叶片清洗、阴干、粉碎、过250 μm筛，按照1∶5 (g/mL)比例加入石油醚回流2.5 h，除去叶片中的色素、挥发油等物质后风干备用。

1.2.2 太空茄叶黄酮粗提取的制备 准确称取预处理的50 g 太空茄子叶粉末，按照1∶42 (g/mL)比例加入78%的乙醇，80 ℃回流提取1.8 h，冷却后真空抽滤，收集上清液，减压浓缩回收乙醇，冷冻干燥后得太空茄叶黄酮浸膏；称取2.5 g 黄酮浸膏，用去离子水溶解，移至250 mL容量瓶并定容，得到质量浓度1.79 mg/mL的黄酮溶液，冷藏备用。

1.2.3 太空茄子叶黄酮含量的测定 参照文献[11]，根据式(1)计算黄酮含量。

(1)

式中：

Y——黄酮含量，%；

C——标准曲线上查得黄酮质量，μg；

V——黄酮提取液总体积，mL；

N——样品的稀释倍数；

M——样品的重量，g；

VS——测定时所取溶液的体积，mL。

1.3 最佳树脂筛选

1.3.1 树脂预处理 试验选用的5种树脂分别用无水乙醇浸泡24 h后过滤，采用去离子水冲洗至无乙醇味；吸干树脂表面水分后用5% HCl浸泡3 h；去离子水冲洗至中性，用2% NaOH浸泡3 h，去离子水洗至中性，吸干树脂水分后备用[12-13]。

1.3.2 树脂吸附率和解吸率测定 取5种预处理后大孔树脂各2.0 g，置于100 mL三角瓶中，分别加入一定浓度的黄酮溶液15 mL，在25 ℃、150 r/min恒温振荡24 h 后过滤，测定滤液中黄酮含量；在吸附饱和的树脂中加入15 mL 体积分数为78%的乙醇溶液，振荡解吸24 h后过滤，测滤液中黄酮含量，按式(2)～(4)计算吸附率、解吸率及吸附量[14]。

(2)

(3)

(4)

式中：

α——吸附率，%；

β——解吸率，%；

T——吸附量，mg/g；

C0——初始样液黄酮质量浓度，mg/mL；

V0——初始样液体积，mL；

C1——吸附平衡后黄酮质量浓度，mg/mL；

C2——解吸液中黄酮质量浓度，mg/mL；

M——预处理后树脂质量，g。

1.3.3 静态吸附 取2.0 g预处理树脂NAK-Ⅱ，放置在50 mL 三角瓶中，以吸附时间、黄酮质量浓度、样液pH为单变量，加15 mL黄酮提取液，在25 ℃、150 r/min的条件下振荡吸附饱和后，按前述方法测黄酮含量，计算吸附率。分别以吸附率对时间、浓度、pH作图并绘制静态吸附曲线。

1.3.4 静态解吸 取2.0 g预处理树脂NAK-Ⅱ，以解吸时间、解吸剂体积分数、解吸剂pH值为单变量，加15 mL乙醇解吸液，25 ℃、150 r/min条件下振荡解吸，按前述方法测定解吸液黄酮含量，计算解吸率。分别以解吸时间、解吸剂体积分数、解吸剂pH值作图并绘制静态解吸曲线。

1.3.5 太空茄子叶黄酮的NKA-II树脂柱层析 预处理的NKA-II树脂，湿法装柱(层析柱15 mm×140 mm)，用5倍柱床体积(BV)的蒸馏水除杂后，取质量浓度为362.6 μg/mL的粗黄酮，以1.7 BV/h的流速对黄酮上柱纯化。再用12 BV的蒸馏水除杂后以8 BV、70%的乙醇解吸，每3 min收集2.1 mL，每管取0.3 mL测定黄酮含量。

1.3.6 NKA-II树脂对太空茄子叶黄酮的纯化效果 分别称取0.1 g粗黄酮和经纯化后的黄酮，用78%的乙醇溶解后定容至50 mL，各取0.4 mL测定黄酮含量，并计算纯化黄酮倍数。

1.3.7 纯化前后太空茄子叶黄酮抗氧化活性

(1) 对DPPH·清除力：根据文[15～16]修改如下，吸取质量浓度为33.6，16.8，13.4，6.7，4.5，3.4，2.7 μg/mL的纯化前后黄酮液2.00 mL，分别加入0.15 mmol/L DPPH溶液2 mL，混合均匀后常温避光反应30 min，在517 nm下测定吸光值Ai，并以2.00 mL黄酮液和2.00 mL 95%乙醇为样品空白组，以相同质量浓度的芦丁为阳性对照。按式(5)计算清除率。

(5)

式中：

CR——清除率，%；

A0——未加黄酮液样品的吸光度；

Aj——相应质量浓度黄酮液的本底吸光度；

Ai——样品组吸光值。

(2) 对ABTS+·清除力：根据文献[17]。按式(5)计算ABTS+·清除率。

1.4 数据统计与处理

采用Excel 2003进行数据处理，使用SPSS 16.0软件统计分析，不同树脂之间的显著性差异采用新Duncan复极法进行比较。试验重复3次。

2 结果分析

2.1 最佳树脂类型的筛选

如表2所示，D101与D4020差异不显著，但NAK-Ⅱ与其他树脂差异显著；从解吸率看，NAK-Ⅱ与D4020差异不显著，NAK-Ⅱ与其他树脂差异显著。X-5的解吸率较高，但其吸附率最低；NAK-Ⅱ吸附率和解吸率均最高。综合吸附率、解吸率和吸附容量3个参数，得出NAK-Ⅱ类型树脂是较好的吸附树脂，以下试验用NAK-Ⅱ大孔树脂对太空茄子叶黄酮进行纯化。

2.2 静态吸附试验

2.2.1 吸附时间对NAK-Ⅱ树脂吸附率的影响 从图1中

表2 5种树脂对太空茄子叶黄酮吸附率与解吸率的影响†

Table 2 Effects of 5 macroporous resins on absorption and desorption rates of flavonoids from eggplant leaves

树脂型号总黄酮吸附容量/(mg·g-1)总黄酮吸附率/%总黄酮解吸率/%D10111.2083.44b68.23dcD402011.2483.75b71.00abX-59.7972.92d70.88abAB-810.6079.00c64.24dNKA-II12.9796.64a71.29a

† 同列不同字母表示差异显著(P<0.05)。

图1 吸附时间对太空茄叶黄酮吸附率的影响Figure 1 Effects of absorption time on adsorption rates of flavonoids from eggplant leaves

可看出，吸附时间在0.5～1.0 h时吸附率增长迅速，1.0 ～2.5 h 时吸附速率较快，2.5 h后达到平衡，之后随着时间继续延长，吸附率变化趋于平缓。因此，确定吸附时间为2.5 h。

2.2.2 样品质量浓度对NAK-Ⅱ树脂吸附的影响 由图2可知，太空茄子叶黄酮的吸附率随其质量浓度的升高呈先上升后下降趋势，当黄酮质量浓度为0.362 6 mg/mL时吸附率达最大值(98.257 4%)；继续增大黄酮质量浓度，吸附率开始降低。可能是黄酮浓度越高，其结构中含有酚羟基、羰基官能团容易构成氢键而聚合成大分子，不易被吸附。因此，黄酮粗提液最佳质量浓度为0.362 6 mg/mL。

2.2.3 黄酮粗提取液pH对NAK-Ⅱ树脂吸附的影响 从图3可以看出，太空茄子叶黄酮的吸附率随其粗提液pH值的升高呈下降趋势，当pH值为2时黄酮的吸附率最高(97.49%)。原因可能是pH值较小时，弱酸性黄酮类物质呈现为分子形式，通过范德华力相互作用被吸附；当pH值过高时，黄酮类分子中酚羟基H+容易失去，形成离子结构，不易被树脂吸附。因此，适宜的黄酮粗提液pH值为2。

图2 样品浓度对太空茄叶黄酮吸附率的影响

Figure 2 Effects of sample concentrations on absorption rates of flavonoids from eggplant leaves

图3 样液pH对太空茄叶黄酮吸附率的影响Figure 3 Effects of sample pH on absorption rates of flavonoids from eggplant leaves

2.3 静态解吸试验

2.3.1 太空茄子叶黄酮在NAK-Ⅱ树脂上的解吸曲线 由图4可以看出，解吸时间在前10 min内，解吸率随时间的延长增长较快；10 min后，吸附率增长较缓慢；当解吸时间到40 min时，解吸基本趋于平衡。因此，确定解吸时间为40 min。

图4 解吸时间对太空茄子叶黄酮解吸率的影响Figure 4 Effects of time on desorption rates of flavonoids from eggplant leaves

2.3.2 乙醇浓度对NAK-Ⅱ树脂解吸效果的影响 黄酮类化合物大部分为极性且其范围较广泛。依据“相似相容”原理，不同极性的黄酮类化合物能溶于不同体积分数的乙醇。从图5可以看出，随乙醇体积分数的升高，解吸率先上升后下降；乙醇体积分数为70%时，解吸率达到最大值(72.79%)。因此，宜选用70% 的乙醇作洗脱剂。

2.3.3 解吸pH对NAK-Ⅱ树脂解吸效果的影响 从图6可以看出，随着乙醇pH值增大，黄酮解吸率呈下降趋势。乙醇为极性溶剂，可使大孔树脂溶胀，降低了树脂的吸附力，但酸的电离作用可提高乙醇溶液的极性，从而增强大孔树脂的解吸率。试验宜选用pH 为3的乙醇为洗脱液。

2.4 太空茄子叶黄酮的动态洗脱曲线

太空茄子叶黄酮的动态洗脱曲线见图7。当用去42 mL(第20管)洗脱液时，达到洗脱最高峰；当洗脱液用去8 BV(即200 mL时)，洗脱液几乎呈无色，说明太空茄子叶黄酮已基本解吸完全。表明采用体积分数 70%、pH值为3.0的乙醇溶液可以较好地解吸NKA-II树脂吸附的太空茄子叶黄酮，同时也表明NKA-II树脂对太空茄子叶黄酮的静态试验结果是可行的。

图5 乙醇浓度对太空茄叶黄酮解吸率的影响

Figure 5 Effects of ethanol concentrations on desorption rates of flavonoids from eggplant leaves

图6 解吸pH对太空茄子叶黄酮解吸率的影响Figure 6 Effects of pH on desorption rates of flavonoids from eggplant leaves

图7 太空茄子叶黄酮的动态洗脱曲线Figure 7 Dynamic elution curve of flavonoids from eggplant leaves

2.5 NKA-II树脂对太空茄子叶黄酮的纯化效果

纯化后的太空茄子叶黄酮液经浓缩干燥后为黄色粉末，测定其干物质中黄酮含量为64.59%，而粗品中黄酮含量为17.91%，由此可见，纯化后干物质中黄酮质量分数明显提高，是粗提物的3.61倍。

2.6 对DPPH自由基的清除能力

DPPH·是一种稳定的氮中心自由基，可捕获(清除)其它自由基，其醇溶液呈现深紫色，中和后会变无色或浅黄色，在517 nm处有一强吸收峰。DPPH·存在单电子，加入样品后，抗氧化物质释放的电子与DPPH·配对，使其吸收能力下降，颜色由深变浅。颜色的变化与其接受电子数呈定量关系，因此可以通过褪色程度来衡量清除活性的大小。太空茄子叶黄酮对DPPH·清除力见图8和表3。

图8 太空茄子叶黄酮对DPPH·的清除率Figure 8 Scavenging effects of flavonoids from eggplant leaves on DPPH·表3 清除DPPH·的IC50值†Table 3 The IC50 values for scavenging DPPH·

样品对数回归方程R2IC50值/(μg·mL-1)芦丁 y=28.537ln(x)-18.3460.911 310.97纯化前黄酮y=28.648ln(x)-33.2850.940 118.31纯化后黄酮y=27.782ln(x)-33.7680.966 120.39

†y为DPPH·清除率，%；ln(x)为纯化前后对应黄酮或芦丁质量浓度的对数。

由图8可知，在试验范围内，随着各样品质量浓度的增大，DPPH·清除率均呈递增趋势。由表3可知，IC50值可确定清除DPPH·能力大小依次为芦丁>纯化前>纯化后，说明纯化前太空茄子叶黄酮所含的清除DPPH·的成分较纯化后多。

2.7 对ABTS+·的清除能力

ABTS+·是一种ABTS经氧化生成稳定的蓝绿色水溶性自由基。ABTS+·清除法目前已广泛用于生物总抗氧化力测定中。当加入样品后，若含有抗氧化物质提供供氢体，使其溶液颜色变浅，导致在734 nm处的特征吸光度降低。溶液褪色变化与抗氧化剂浓度呈正比，因此依据溶液褪色变化，可以判断提取物或检测物的抗氧化能力，太空茄子对ABTS+·的清除能力见图9和表4。

从图9可以看出，本试验范围内，ABTS+自由基的清除率是随样品质量浓度的升高呈上升趋势，在太空茄子叶黄酮含量为13.4 μg/mL时，ABTS+·清除率趋于平缓，达到97%左右。由表4可知，IC50值可确定ABTS+·清除能力大小依次为芦丁>纯化后>纯化前。

3 结论

试验对太空茄子叶黄酮纯化参数及抗氧化活性进行了研究，得出NKA-II是分离纯化黄酮的理想吸附剂，吸附平衡时间为2.5 h；解吸平衡时间为40 min；在吸附液pH为2.0、浓度为362.6 μg/mL时吸附能力最强；pH值为3.0、体积分数为70%的乙醇洗脱效果最好，黄酮解吸率随乙醇体积分数的增加呈先升高后下降的趋势，此变化趋势与前人[18]研究结果一致。NKA-II纯化后黄酮对ABTS+·清除能力大于纯化前，纯化后黄酮对DPPH·清除能力则小于纯化前，纯化前后黄酮对ABTS+·、DPPH·清除能力均小于芦丁。使用该方法，效率高、成本低、操作简单，易实现太空茄子叶黄酮工业化生产。后续将对黄酮的组分与结构进行研究，建立NKA-II大孔树脂吸附黄酮的动态吸附传质方程，为固定床吸附设备的设计提供参考依据。

图9 太空茄子叶黄酮对ABTS+·的清除率Figure 9 Scavenging effects of flavonoids from eggplant leaves on ABTS+·表4 清除ABTS+·的IC50值†Table 4 The IC50 values for scavenging ABTS+·

样品对数回归方程R2IC50值/(μg·mL-1)芦丁 y=13.636ln(x)+56.3670.828 40.63纯化前黄酮y=19.345ln(x)+37.8010.874 11.88纯化后黄酮y=19.069ln(x) + 39.770.885 61.71

†y为ABTS+·清除率，%；ln(x)为纯化前后对应黄酮或芦丁质量浓度的对数。