子宫腔脱落细胞的DNA倍体分析技术应用于子宫内膜病变筛查的研究

华诏召　曾莉　曹俊岩

[摘要] 目的 探討子宫腔脱落细胞的DNA倍体分析技术应用于子宫内膜病变筛查的可行性及应用价值。 方法 选取2014年1月～2016年5月就诊于贵阳中医学院第二附属医院疑似子宫内膜病变患者500例为研究对象，采集子宫腔脱落细胞标本，采用Feulgen染色和全自动DNA倍体分析系统分析患者DNA倍体情况，同时行分段诊断性刮宫术检测，以分段诊断性刮宫术检测结果为金标准，观察DNA倍体分析对诊断子宫内膜病变的敏感性和特异性。 结果 分段诊断性刮宫术检测发现，子宫内膜癌39例（78.0%），癌前病变98例（19.6%），子宫内膜量增生258例（51.6%），正常子宫内膜105例（21.0%）。子宫腔脱落细胞DNA倍体分析子宫内膜癌检出率相似于病理检查，差异无统计学意义（P > 0.05）；子宫腔脱落细胞DNA倍体分析癌前病变检出率相似于病理检查，差异无统计学意义（P > 0.05）。以病理活检结果为金标准，DNA倍体分析筛查子宫内膜病变的敏感性、特异性、准确度分别为92.7%、83.8%、86.2%，DNA倍体分析筛查子宫内膜癌的敏感性、特异性、准确度分别为94.9%、67.7%、69.8%。 结论 DNA倍体分析对子宫内膜癌的筛选敏感性高，可用于子宫内膜病变的早期筛查，具有一定临床推广价值。

[关键词] 子宫腔脱落细胞；DNA倍体分析；子宫内膜病变；筛查

[中图分类号] R737.33 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）04（b）-0087-05

[Abstract] Objective To investigate the feasibility and application value of DNA quantitative analysis of uterine cavity exfoliated cells in screening endometrial lesions. Methods Five hundred patients with suspected endometrial lesions from January 2014 to May 2016 in the Second Affiliated Hospital of Guiyang Traditional Chinese Medicine College were selected as the research objects， specimens of uterine cavity exfoliated cells were collected， DNA ploidy was analyzed by Feulgen staining and automatic DNA quantitative analysis system， segmented diagnostic curettage was performed at the same time， the segmented diagnostic curettage results were the gold standard， the sensitivity and specificity of DNA quantitative analysis in diagnosis of endometrial lesions was observed. Results Segmental diagnostic curettage detection showed， 39 cases of endometrial carcinoma （78.0%）， 98 cases of precancerous lesion （19.6%）， 258 cases of endometrial hyperplasia （51.6%）， 105 cases of normal endometrium （21.0%）. The detection rate of endometrial carcinoma of DNA ploidy analysis of uterine cavity exfoliated cells was similar to pathological examination， the difference was not statistically significant （P > 0.05）. DNA ploidy analysis of exfoliated uterine cavity precancerous lesions were similar to the pathological examination， the difference was not statistically significant （P > 0.05）. With the pathological biopsy results as the gold standard， the sensitivity， specificity and accuracy of endometrial lesions DNA quantitative analysis were 92.7%， 83.8% and 86.2% respectively. The sensitivity， specificity and accuracy of DNA quantitative analysis in screening endometrial cancer were 94.9%， 67.7% and 69.8% respectively. Conclusion DNA quantitative analysis of endometrial cancer has high screening sensitivity， can be used for early screening of endometrial lesions， has a certain clinical value.

[Key words] Uterine cavity exfoliated cells； Image cytometry DNA ploidy； DNA quantitative analysis； Endometrial lesions； Screening

子宫内膜癌（endometrial cancer，EC）是发生于子宫内膜的一组上皮性恶性肿瘤，其死亡率居女性恶性肿瘤第二位，严重威胁女性生命健康[1]。目前子宫内膜癌的诊断主要借助诊刮术进行组织学检查，但其操作复杂，费用高，且存在病情长期监控难、患者依从性差等问题[2]，因此亟需寻找一种质优价廉、安全无痛、简便易行、准确性高的子宫内膜病变筛查方法。脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）倍体分析技术通过定量检测细胞核内染色体数目，并以此为依据判断细胞的良恶性倾向[3]。在癌变和癌前病变细胞中，染色体常常发生非整倍体化，可作为诊断癌及癌前病变的特异性指征[4]。研究发现，细胞DNA定量分析技术可有效提高尿路上皮脱落细胞诊断尿路上皮癌的灵敏度和准确性[5]。陶伟等[6]应用DNA定量分析技术诊断肺癌的敏感度为69.2%，特异度为100.0%，与液基细胞学检查联合能显著提高肺癌的阳性检出率。本课题旨在探讨子宫腔脱落细胞的DNA倍体分析应用于子宫内膜病变筛查中的可行性及应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年1月～2016年5月就诊于贵阳中医学院第二附属医院（以下简称“我院”）疑似子宫内膜病变患者500例为研究对象，年龄30～79岁，平均（59.63±10.31）岁；绝经后患者392例。其中不明原因阴道流血者389例（389/500，77.80%），围经期阴道异常排液者27例（27/500，5.40%）；绝经后阴道异常排液者11例（11/500，2.20%）；绝经后无临床症状但经B超显示宫腔内有不均质占位或子宫内膜厚度超过5 mm者（73/500，14.60%）。纳入标准：①出现不明原因阴道异常出血或排液患者；②明确本研究内容并同意签署知情同意书患者；③有3年及以上性生活史患者；④临床资料完整患者。排除标准：①子宫颈病变引起阴道流血患者；②卵巢病变引起阴道流血患者；③阴道炎等病变引起阴道流血患者；④妊娠期妇女；⑤其他恶性肿瘤或严重全身性疾病患者；⑥中途退出刮宫术检测患者。本研究经我院医学伦理委员会批准通过。

1.2 研究方法

1.2.1 样品采集及保存 DNA倍体分析样品 于就诊当日检查并明确各受试者子宫位置和深度，采用SAP-I子宫内膜细胞采集器（北京赛普九洲科技公司）进入宫腔采集子宫腔脱落细胞，立即置于宫腔细胞保存液（北京赛普九洲科技公司）中，核对患者信息后贴好标签，送至病理科检验DNA。病理检测样品：采集各受试者子宫腔脱落细胞的同时，行宫腔镜诊刮术采集患者宫颈管、宫腔组织标本，置于甲醛中固定，贴好标签，送至病理科检查。

1.2.2 组织病理学检查 每位患者的子宫内膜组织切片经苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色后，经2位资深病理师阅片分析，按照2003年WHO诊断标准进行定性检测[7]，分为以下4类：①未见子宫内膜病变，包括增生期子宫内膜、萎缩性子宫内膜、分泌期子宫内膜；②良性子宫内膜病变，包括子宫内膜炎、子宫内膜息肉、黏膜下肌瘤等；③不典型型子宫内膜增生，即癌前病变；④子宫内膜癌。以此诊断结果为金标准，进行对照诊断研究。

1.2.3 DNA定量分析检测 将“1.2.1”中子宫腔脱落细胞悬液离心5 min，800 r/min，弃上清，重新悬浮下层细胞后，制备细胞薄片，采用福尔根（Feulgen）染色法进行染色、封片。采用Motic BA600-4全自动扫描显微镜（厦门麦克奥迪医疗诊断系统公司）对薄片进行扫描和检测，以薄片中正常细胞作为参照，系统根據收集到的细胞核染色体分布、形态特征、局部特定特征等参数自动对受检细胞进行分类和计数。其中DNA指数（DNA index，DI）可用来表示细胞中DNA含量：0.75≤DI<1.25，为DNA含量为2c的正常细胞；1.25≤DI≤2.50，为DNA含量为2c～5c的疑似病变细胞或增生细胞；DI>2.50，为DNA含量多于5c的病变细胞。参考DNA倍体分析对子宫颈癌的诊断标准[8]，进行分析，结果如下：①阴性病例：薄片内以正常细胞为主，未观察到DI>2.50的病变细胞，且增生细胞比例低于5%；②可疑病例：观察到1或2个DI>2.50的病变细胞或增生细胞比例在5%～10%之间；③阳性病例：观察到3个或以上的病变细胞，或增生细胞比例>10%，其中分析结果为①和②的病例，均规定为DNA异倍体真阴性；③为DNA异倍体真阳性。所有DI>2.50的病变细胞均经资深病理师复核确认，以保证DNA定量分析检测的准确性。

1.2.4 敏感性、特异性、准确度分析 以病理活检结果为金标准，以检测出子宫内膜病变为诊断阳性，计算出DNA倍体分析筛选子宫内膜病变的敏感性、特异性、准确度，敏感性=真阳性/病例组例数，特异性=真阴性/对照组例数，准确度=（真阴性+真阳性）/（对照组例数+病例组例数）。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 子宫内膜组织病理学表现

正常子宫内膜组织子宫内膜形态规则（图1 A），异常增生子宫内膜组织结构不规则（图1 B），子宫内膜癌组织内膜形态极度不规则，出现大量腔隙（图1 C）。

2.2 子宫腔脱落细胞DNA倍体分析结果

DNA倍体分析发现阴性病例子宫内膜组织中以DNA含量为2c的正常细胞为主，未见病变细胞，且增生细胞比例低于5%（图2A）；可疑病例子宫内膜组织中出现大量DNA含量为2.5c～5c的疑似病变细胞或增生细胞，少见DNA含量≥5c的病变细胞（图2B）；阳性病例子宫内膜组织中多为DNA含量为2.5c～5c的疑似病变细胞或增生细胞，DNA含量≥5c的病变细胞增多（图2C）。

2.3 病理学检测结果与子宫腔脱落细胞DNA倍体分析检测结果的比较

子宫腔脱落细胞DNA倍体分析子宫内膜癌检出率相似于病理检查，差异无统计学意义（P > 0.05）；子宫腔脱落细胞DNA倍体分析癌前病变检出率相似于病理检查，差异无统计学意义（P > 0.05）；子宫腔脱落细胞DNA倍体分析子宫内膜良性增生检出率低于病理检查，差异有统计学意义（P < 0.05）；子宫腔脱落细胞DNA倍体分析正常子宫内膜检出率低于病理检查，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

2.4 子宫腔脱落细胞DNA倍体分析筛查子宫内膜病变及子宫内膜癌的诊断效率

以病理活检结果为金标准，DNA倍体分析筛查子宫内膜病变的结果见表2。以病理检查结果为癌前病变和子宫内膜癌作为子宫病变筛查阳性的标准，DNA倍体分析子宫内膜病变筛查的敏感性为92.7%，特异性为83.8%，准确度为86.2%。以病理检查结果子宫内膜癌作为子宫内膜癌筛查阳性的标准，DNA倍体分析子宫内膜病变筛查的敏感性为94.9%，特异性为67.7%，准确度为69.8%。见表3。

3 讨论

子宫内膜癌是发生于女性生殖器最常见的妇科恶性肿瘤之一，近年来其发病呈年轻化趋势[9]。目前对子宫内膜癌的诊治技术虽然已取得一定完善与进步，但子宫内膜癌仍然严重威胁女性的生命健康。早期患者预后好，晚期患者治疗效果差，Ⅳ期患者存活率为5%～15%[10]，由此可见，提高子宫内膜癌早期诊断的精确性对改善患者预后十分重要。因此，必须对子宫内膜病变的早期筛查给予高度重视。

恶性肿瘤的发生源于组织细胞内遗传物质的改变，癌变细胞中DNA倍体多出现异常，染色体数目增多，产生异倍体细胞[11-12]。DNA的异常变化常早于细胞形态学变化，因此测定DNA含量以预测肿瘤的发生可能优于观察细胞形态的变化。Xu等[13]发现，肿瘤较大、分化较高的晚期乳腺癌患者乳腺细胞发生DNA异倍体化的可能性更大，异倍体患者的临床疗效明显弱于二倍体患者。Nishimura等[14]研究表明，胃癌组织中USP44高表达与DNADNA异倍化密切相关，与非整倍体胃癌患者无进展生存期和总体生存期密切相关。Mauland等[15]发现，DNA异倍化与子宫内膜癌患者年龄、FIGO分期和分级、ER/PR阴性以及生存率明显相关，DNA异倍体化是ER/PR阴性子宫内膜癌患者低生存率、高淋巴结转移率和高复发率的危险预测因子。本研究发现，正常子宫内膜组织中细胞内DNA含量为2c，异常子宫内膜组织中出现DNA含量为2.5c～5c的疑似病变细胞或增生细胞，并可见少量DNA含量>5c的病变细胞，癌变子宫内膜组织中多为DNA含量为2.5c～5c的细胞，且DNA含量>5c的細胞增多。提示细胞内DNA倍体的改变与子宫内膜癌发生发展有关。

细胞DNA倍体分析可在组织细胞未发生明显形态学改变前检测出病变细胞，实现早期诊断。Dayal等[16]发现，DNA定量分析可增加p53、HER2等对乳腺癌的预测价值，与患者预后有关。Fadhil等[17]发现DNA定量分析可有效预测结直肠癌的发生。甘密密等[18]发现DNA异倍体细胞数目与宫颈病变程度正相关。本研究发现，在确诊子宫内膜癌病例中，37例为DNA异倍体阳性，癌前病变中，90例为DNA异倍体阳性，子宫腔脱落细胞DNA倍体分析癌前病变检出率相似于病理检查，其筛查子宫内膜病变的敏感性为92.7%，特异性为83.8%，准确度为86.2%，与杨宝华等[19]应用DNA定量分析技术筛查子宫内膜病变的结果基本一致。表明DNA定量倍体分析具有可重复性和客观性，可应用于子宫内膜病变的筛选。进一步分析发现，子宫腔脱落细胞DNA倍体分析子宫内膜癌检出率相似于病理检查，其筛查子宫内膜癌的敏感性高达94.9%，特异性和准确度分别为67.7%和69.8%。提示DNA倍体分析可有效筛查出子宫内膜癌高危患者，从而有针对性地进行组织活检。

本研究中有2例子宫内膜癌患者未检测出DNA异倍体阳性，回顾性分析患者的临床资料发现，漏诊患者均表现出绝经期阴道不规则出血症状，由于子宫内膜癌的发生、发展是一个由子宫内膜良性增生到不规则增生再到癌变的连续恶化过程[20]，任意阶段病变均可能导致阴道不规则流血的发生。另外，有时肿瘤的发生不涉及DNA倍体的变化，推测漏诊患者可能是二倍体肿瘤。而DNA倍体分析只能检测出DNA倍体发生变化的肿瘤患者，无法检测出二倍体肿瘤患者，因此，对可疑病例须结合诊断性刮宫术进行组织病理学检测，以提高DNA倍体分析筛选子宫内膜癌的准确性。

综上所述，子宫腔脱落细胞DNA倍体分析技术安全易行，敏感性高，且具有可重复性，可应用于子宫内膜病变尤其是子宫内膜癌的筛查，具有重要的应用价值。但本研究所选病例局限于贵州地区，且数据量较小，尚需要扩大研究范围，增加病例数目进一步验证。

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（收稿日期：2017-12-12 本文编辑：任 念）