3种处理方法对银杏种仁中氢氰酸和4-甲氧基吡哆醇质量分数的影响1)

花彤彤　曹福亮　徐莉　郁万文　薛源

(南京林业大学南方现代林业协同创新中心，南京，210037)

银杏果作为药食同源物，种仁中含有营养成分如糖、蛋白质等，药用成分如黄酮、萜内酯等[1]，广受青睐。银杏种仁内含有氢氰酸、银杏酸、银杏酚酸、白果二酚、MPN和致敏蛋白等物质[2-8]。食用银杏果引起的中毒事件时有报道[9]。氢氰酸属于剧毒类物质，对人体危害较大，人吸入高质量分数的氢氰酸气体会引起呼吸停止而死亡[10]。MPN作为一种抗维生素B6的神经毒素，当误食时会引起呕吐、休克等症状[5]。目前国内对银杏果中氢氰酸和MPN质量分数的研究较少，多集中于银杏酸、银杏酚酸、白果二酚和致敏蛋白质量分数的研究。本研究采用氰离子选择电极和高效液相色谱检测经过微波加热、豆油翻炒、沸水煮3种处理的8个无性系银杏种仁中氢氰酸和MPN质量分数，来确定较为安全的银杏种仁加工食用方法，降低中毒几率，并比较8个无性系银杏种仁中氢氰酸和MPN质量分数，筛选出质量分数较低的无性系，为优良种质资源的选择提供一定的依据。

1　材料与方法

1.1　材料

供试材料采自江苏省邳州市陈楼镇银杏种质资源圃。1990年，从全国主要的银杏产区(江苏、山东、广西、贵州)引进核用优株枝条，用2～3 m高的5年生的实生幼树作砧木，起始嫁接部位在1.8～2.0 m，每株砧木嫁接3～4根接穗，每个无性系嫁接3～6株。参试8个无性系的编号和母株原产地见表1。定植株行距为7 m×6 m，树冠轮廓多为半圆形。2016年10月份采集银杏果，每株嫁接树分东西南北4个方向，每个方向采果20颗，混合所有采集的果实，去除外种皮后存放于阴暗、通风的房间待用。

表1　无性系名称及原产地

1.2　方法

1.2.1样品的制备

取上述银杏果，人工去除中种皮和内种皮，取银杏种仁。进行以下4种实验处理，将处理后的银杏种仁磨成粉，-80 ℃存放于冰箱中待用。

处理①豆油翻炒：取不同无性系银杏种仁于热锅内炒至表面金黄色，有裂纹，具香气，冻干。

处理②沸水煮：取不同无性系银杏种仁于锅内，加适量水煮20 min后取出，冻干。

处理③微波加热：取不同无性系的银杏种仁于微波炉中加热2 min，具香气，冻干。

对照：取不同无性系银杏种仁直接冻干。

不同部位样品制备：镊子取出种仁中胚，将胚和胚乳冻干。冻干样品磨成粉，-80 ℃存放于冰箱中待用。

1.2.2氢氰酸质量分数测定

通过酶解法将银杏种仁中氰苷水解为氢氰酸和苯甲醛后，氢氰酸溶解在水中，直接用氰离子选择电极检测溶液中氰根离子的浓度，根据溶液中氰根离子的浓度计算银杏种仁中氢氰酸的质量分数[11-15]。

1.2.3MPN质量分数测定

1.2.3.1色谱条件

色谱柱：Waters Xbridge C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；梯度洗脱20 min，流动相A：6%～12%乙腈，流动相B：水(5 mM KH2PO4+C5H11NaO3S，pH=2.8)；检测波长278 nm，流速1 mL/min，柱温30 ℃。

1.2.3.2标准曲线绘制

精密称取6 mg的MPN对照品，蒸馏水定容至100 mL。用0.45 μm滤膜过滤，配制不同质量浓度系列(1、5、10、25、50、100 μg/mL)的MPN对照品溶液，经HPLC检测后，记录峰面积(Y)后与质量分数(X)进行线性回归计算，得到对照品的回归方程。

MPN对照品的回归方程为：Y=49 136X-26 674，R2=0.999 6。其中：Y为峰面积：X为对照品质量分数；R2为相关系数。

1.2.3.3样品液制备

精确称取不同方法处理的银杏种仁冻干粉各1 g。将1 g样品置于50 mL试管中，加入20 mL蒸馏水，水浴锅100 ℃提取2 h，滤纸过滤；滤渣加20 mL蒸馏水，水浴锅中100 ℃提取2 h，过滤，合并提取液，蒸馏水定容至50 mL；用0.45 μm滤膜过滤，计算MPN的峰面积，根据外标曲线求得MPN质量分数。

1.2.3.4HPLC方法的精密度测定

取同一对照品溶液，连续进样6次，每次进样10 μL，测定其峰面积，计算其精密度。

1.2.3.5样品加样回收率测定

称取已测定MPN质量分数的银杏种仁冻干粉1 g，4个重复，加一定量的MPN对照品，按照1.2.3.3方法处理样品并检测，计算平均回收率和相对标准偏差。

2　结果与分析

2.1　生银杏种仁中氢氰酸质量分数

银杏种仁由胚乳和胚两部分组成，经过酶解的不同无性系生银杏胚乳和胚中氢氰酸质量分数都可以通过氰离子选择电极来测定。银杏胚中的氢氰酸质量分数是胚乳的11～16倍。由表2可知，不同无性系的银杏胚乳和胚中的氢氰酸质量分数有极显著差异(P<0.01)。由表3可知，不同无性系的银杏胚乳中氢氰酸的质量分数有显著差异，在5.64～9.88 μg/g。其中氢氰酸质量分数由低到高为新村18号、长兴1号、正安3号、桂林6号、叶籽银杏、正安1号、长兴4号、藤久郎，胚中质量分数最低的是新村18号为78.96 μg/g，最高的是藤久郎为158.37 μg/g。种仁中质量分数最高的无性系为藤久郎，最低的无性系为新村18号。

表2　不同无性系生银杏种仁中氢氰酸质量分数的方差分析

表3　不同无性系生银杏种仁中氢氰酸的质量分数

注：表中数值为平均值±标准差。

2.2　生银杏种仁中MPN质量分数

2.2.1HPLC色谱图分析

从图1可以看出，MPN对照品与银杏种仁中提取物相同。图2中MPN峰与其他杂峰得到了较好的分离，且基线稳定。

图1　MPN对照品的HPLC图谱

图2　银杏胚乳提取物MPN的HPLC图谱

2.2.2精密度试验

将MPN对照品溶液(10 μL)按照上述色谱条件重复进样测定6次，根据对照品峰面积计算出相对标准偏差(须小于2%)为1.2%，表明仪器精密度良好。

2.2.3样品加样回收率

对HPLC测定方法的准确性进行了测定，根据1.2.3.5测定并计算MPN加样回收率为94.1%～98.5%，相对标准偏差=1.16%(n=4)。由此可见，该测定方法的准确度良好。

2.2.4生银杏种仁中MPN质量分数

MPN作为一种抗维生素B6神经毒素，具有高水溶性，用水作为提取溶剂提取的银杏种仁中的MPN的质量分数见表5。可知，不同无性系的银杏种仁中MPN的质量分数差异不显著，在89.33～103.51 μg/g。其中MPN质量分数由低到高为新村18号、桂林6号、正安1号、正安3号、藤久郎、长兴4号、长兴1号、叶籽银杏，质量分数最高的无性系为叶籽银杏，最低的无性系为新村18号。

表4　不同无性系生银杏种仁中MPN质量分数方差分析

表5　不同无性系生银杏种仁中MPN质量分数

注：表中数值为平均值±标准差。

2.3　不同处理后银杏种仁中氢氰酸和MPN质量分数

2.3.1不同处理后银杏种仁中氢氰酸的质量分数

不同处理的不同无性系银杏种仁中氢氰酸的质量分数可用氰离子选择电极检测得出。通过表6可见不同方法处理后银杏种仁中的氢氰酸的质量分数有显著差异(P<0.01)。由表7可知，经过不同处理后，氢氰酸的质量分数变化的趋势相同，微波加热和豆油翻炒后的质量分数增加，沸水煮后的质量分数降低。微波加热处理后的银杏种仁中氢氰酸质量分数最高，经过微波加热处理后的银杏种仁中氢氰酸的质量分数增加了3.8%～51%；豆油翻炒处理后的银杏种仁中氢氰酸的质量分数增加了1.4%～13%；沸水煮后的银杏种仁中氢氰酸的质量分数降低了0.6%～58%。不同无性系的银杏种仁中氢氰酸质量分数之间也有显著性差异(P<0.01)，新村18号、长兴1号质量分数较低，藤久郎质量分数最高。

表6　不同处理方法处理后不同无性系银杏胚乳种仁中氢氰酸质量分数的方差分析

表7　不同处理方法处理后不同无性系银杏种仁中氢氰酸质量分数

注：表中数值为平均值±标准差。

2.3.2不同处理后银杏种仁中MPN的质量分数

银杏种仁经过不同处理后，其中MPN有所变化，由表8可知不同处理间有极显著差异(P<0.01)，通过表9可知，豆油翻炒处理后的银杏种仁中MPN质量分数最高，是未处理的22%～41%；微波加热处理后的银杏种仁中MPN质量分数是未处理的0.9%～32%；而沸水处理后的银杏种仁中MPN质量分数相对于未处理的降低了1.6%～34%。不同无性系的银杏种仁之间也有显著性差异(P<0.01)，新村18号、长兴1号质量分数较低，叶籽银杏质量分数最高。

表8　不同处理方法处理后不同无性系银杏种仁中MPN质量分数的方差分析

表9　不同处理方法处理后不同无性系银杏种仁中MPN质量分数

注：表中数值为平均值±标准差。

3　结论与讨论

当银杏种仁中的细胞被破坏后，细胞里的糖苷酶就会释放出来分解氰苷，生成剧毒的氢氰酸。人和动物体内也含有糖苷酶，在食用了含有氰苷的食物后，人体内的糖苷酶与生氰糖苷发生水解反应，生成氢氰酸引起中毒[10,12-13]。本试验通过加入外源的糖苷酶，使银杏种仁中的生氰糖苷水解释放出氢氰酸。本试验的结果分析可知，经过不同处理的银杏种仁中的氢氰酸质量分数差异：微波加热、豆油翻炒后银杏种仁中氢氰酸的质量分数比未处理的生银杏种仁中高，经沸水煮的银杏种仁中的氢氰酸的质量分数比未处理的低。微波炉加热处理后银杏种仁中氢氰酸的质量分数增加，是因为在加热过程中，细胞里的作为酶解反应催化物的水被快速且大量消耗。同时温度的快速上升使得酶失活，银杏中较少的生氰糖苷被酶解为氢氰酸，但是与未处理的银杏种仁中的质量分数差异不显著。豆油翻炒法提高了银杏中的氢氰酸质量分数的机制与微波处理类似，主要是因为在热油高温影响下，银杏种仁中的参与酶解反应的糖苷酶部分失活，被酶解释放出的氢氰酸质量分数相应减少；水煮法处理后氢氰酸质量分数降低是因为银杏种仁在水中加热时，随着温度的逐渐升高，糖苷酶的活性变高，酶解了大量的生氰糖苷，生成了氢氰酸被释放出来[16-22]。

维他命B6是许多酶促反应的主要成分，如促进氨基酸和神经传递素的新陈代谢等。MPN抑制了维他命B6的酶促反应中的一种谷氨酸脱氢酶GAD的活性，使酶促反应过程不能正常完成，从而引起抽搐，呕吐等中毒反应。试验结果表明，经过不同处理后的银杏种仁中的MPN质量分数有差异：微波加热、豆油翻炒后银杏种仁中MPN质量分数高，而经过沸水煮后的银杏种仁中的MPN质量分数比未处理的生银杏种仁中低。维他命B6的水溶性很高，MPN作为其衍生物也具有很高的水溶性，在沸水加热过程中，大部分已溶解在水中，银杏种仁中的质量分数降低[4]。因此，在食用时，尽量选择沸水煮后的银杏，降低中毒的几率。

国家标准规定，市场上可供食用的杏仁中氢氰酸的质量分数不得超过20 μg/g，银杏胚乳中质量分数最高的为9.88 μg/g，未超过该质量分数，但胚中质量分数高至158.37 μg/g，胚中的氢氰酸的质量分数比胚乳中质量分数高至11～16倍，因此在生食时需将胚去除，提高食用安全性。目前国内对于食用品中MPN的最低安全食用质量分数还没有相关规定。

此外，根据试验结果可知，不同无性系银杏种仁中的氢氰酸和MPN质量分数也存在显著性差异。本研究中氢氰酸质量分数最高的是藤久郎，质量分数最低的是新村18号，藤久郎是新村18号的1.75倍；MPN质量分数最高的是叶籽银杏，质量分数最低的是新村18号。在银杏果用无性系的选择可将其作为参考之一，且在银杏果的加工利用方面有重要意义。