动脉球囊损伤后主动脉组织中Atox1和Lox表达及缬沙坦对其影响

赵坤　侯勃　王茂敬　赵青　李培慧　蔡尚郎

[摘要]目的研究血管内皮球囊损伤后铜伴侣蛋白1（Atox1）、赖氨酸氧化酶（Lox）的表达及缬沙坦对其影响，探讨Atox1、Lox及缬沙坦在血管再狭窄中的作用。

方法Wistar大鼠36只，随机分为对照组、手术组和药物组，各12只。制备大鼠主动脉球囊损伤后再狭窄动物模型，药物组给予缬沙坦灌胃，对照组、手术组给予生理盐水灌胃，各组分别于术后14、28 d取6只大鼠腹主动脉，检测主动脉内膜、中膜厚度，Atox1、Lox mRNA及蛋白表达。

结果与对照组比较，手术组术后14、28 d主动脉内膜、中膜增厚，Atox1、Lox mRNA及蛋白表达明显上升；与手术组比较，药物组术后14、28 d主动脉内膜、中膜增生减轻，Atox1、Lox mRNA及蛋白表达下降，差异有显著性（F=25.73～34.16，P<0.05）。

结论Atox1、Lox参与大鼠主动脉球囊损伤后内膜增生过程；缬沙坦可抑制内膜增生，其作用与下调Atox1、Lox的表达有关。

[关键词]内皮，血管；铜伴侣蛋白1；赖氨酸氧化酶；缬沙坦

[中图分类号]R361.2

[文献标志码]A

[文章编号] 20965532（2018）02022504

冠状动脉粥样硬化性心脏病（CHD）是目前常见的慢性疾病之一，其发病率逐年增加，病死率较高，已经成为威胁人类健康的首位疾病[1]。经皮冠状动脉介入治疗（PCI）已成为CHD治疗的重要手段，但PCI术后再狭窄却是一个尚未解决的难题，其半年内再狭窄的发生率高达40%。药物洗脱支架的诞生虽明显降低再狭窄率，但仍可达6.4%[23]。血管平滑肌细胞（VSMC）迁移和增殖是PCI术后再狭窄的主要机制[4]，而血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）参与了此过程。AngⅡ主要通过血管紧张素1（AT1）型受体引起新生内膜形成[5]。铜是维持人体正常生理功能的一种必不可少微量元素，其在创伤修复、血管再生等生理修复过程和肿瘤生長、神经变性疾病、动脉粥样硬化等病理生理过程中起重要作用[68]。研究证实铜水平影响动脉粥样硬化的形成[9]，在血管损伤时增加铜的水平可加剧动脉狭窄[10]。铜伴侣蛋白1（Atox1）是一种铜伴侣蛋白，具有保护细胞、抵抗氧化的功能，并在细胞内对铜转移、储存、

分布起重要作用[11]。研究表明，Atox1表达增加可引起VSMC的增殖和迁移[12]。赖氨酸氧化酶（Lox）是一种铜依赖性氨基氧化酶，能够参与细胞外胶原和弹性纤维的赖氨酸残基交联，以维持细胞外基质的正常结构和功能，并在VSMC迁移、细胞外基质聚集等过程中发挥重要作用。已有研究显示，Atox1和Lox参与球囊损伤术后再狭窄的过程[1314]，参与了AngⅡ引起的血管增生、重塑及细胞外基质聚集等[1516]。缬沙坦是一种AngⅡ受体拮抗剂（ARB），其能够抑制血管损伤后再狭窄的形成[1718]，但在血管损伤中使用缬沙坦对Atox1和Lox表达影响及其机制尚不清楚。因此，本文对Atox1、Lox及缬沙坦在血管再狭窄中的作用进行探讨。

1材料和方法

1.1动物分组及处理

选取雄性Wistar大鼠36只（购自青岛市动物中心），体质量300～350 g，随机分为对照组、手术组和药物组，各12只。手术组：用0.6 mol/L水合氯醛（3.5 mL/kg）腹腔注射麻醉，沿颈前正中线切开皮肤，暴露左侧颈总动脉及颈内、颈外动脉，自颈外动脉送入自制球囊至腹主动脉，并且注入生理盐水0.15～0.20 mL使球囊充分膨胀，慢速回拉球囊至主动脉弓，反复3次；退出球囊，结扎颈外动脉，逐层缝合。术后常规用青霉素40万单位预防感染，常规饲养，术前1 d至实验终点前给予生理盐水3 mL灌胃。药物组：手术操作同手术组，术前1 d至实验终点给予缬沙坦（北京诺华制药有限公司）20 mg·kg-1·d-1，溶于生理盐水3 mL灌胃。对照组：将球囊送至腹主动脉缓慢回拉球囊至主动脉弓，反复3次，不扩张球囊，其余操作同手术组，术前1 d至实验终点给予生理盐水3 mL灌胃。

1.2标本制备及组织学检查

选择术后14、28 d为实验终点，在相应终点3组各处死6只大鼠，剪取腹主动脉近主动脉弓端5 mm动脉血管，置于40 g/L甲醛中固定，制作石蜡包块，行常规苏木精伊红（HE）染色和免疫组化检查。其余血管段-80 ℃冻存。HE染色后光镜下观察VSMC移行、增殖及内膜增厚情况并拍照。

1.3实时荧光定量PCR检测血管组织中Atox1及Lox mRNA的表达

分别取各组血管标本，充分剪碎研磨后加入Trizol试剂（美国，Invitrogen公司）1 mL裂解，在无RNA酶的环境中，Trizol法提取总RNA，紫外线分光光度计测定RNA纯度，A260/A280为1.7～2.0，提示RNA纯度较高。应用实时定量RTPCR试剂盒检测血管组织中Atox1、Lox mRNA表达水平。PCR引物及其序列见表1。逆转录获得cDNA（42 ℃、60 min，70 ℃、10 min），-20 ℃储存。PCR反应条件：95 ℃、2 min，95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，循环40次。检测得到循环阈值（Ct值），以βactin作为内参校准基因，用相对定量方法计算2-△△Ct，以其表示基因相对表达量。

1.4免疫组化检测Atox1蛋白表达

将腹主动脉蜡块切片，采用链霉亲和素生物素过氧化物酶复合物法进行Atox1免疫组织化学染色，按试剂盒（美国Santan Gruz公司）说明书进行操作。DAB显色，苏木精复染。以磷酸盐缓冲液替代一抗作为对照。光学显微镜下观察，Atox1表达于平滑肌细胞的细胞核和细胞浆，阳性染色表现为细胞核、细胞浆棕色。应用Imageproplus Software 5.0图像分析软件，以累计光密度值表示该蛋白的相对表达量。

1.5酶联免疫法检测Lox蛋白表达

取冻存的血管片段35 mg，研磨、匀浆，3000 r/min离心20 min后提取上清液，酶联免疫法检测Lox水平，按试剂盒（武汉中美科技有限公司）说明书进行操作，使用酶标仪测定结果。

1.6统计学处理

应用SPSS 17.0统计软件进行数据处理，计量资料结果用[AKx-D]±s表示，多组数据间比较采用方差分析，两两比较用LSDt检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1各组大鼠主动脉组织学比较

手术组14 d内膜、中膜明显增生，以内膜为主，其中可见大量VSMC增殖，排列紊乱，内弹力层较为迂曲；28 d增生更加明显，其细胞外基质成分增加，但VSMC增殖已明显减少。药物组14 d和

28 d内膜增生较手术组明显减轻，增生及移行至内膜的VSMC数量降低，细胞外基质成分显著减少。与对照组比较，手术组术后14、28 d主动脉内膜、中膜厚度增加；与手术组比较，药物组主动脉内膜、中膜厚度降低，差异有显著性（F=25.79～28.76，P<0.05）。见表1。

2.2各组Atox1、Lox mRNA表达水平比较

术后14、28 d，手术组Atox1、Lox mRNA表达较对照组明显增高，药物组Atox1、Lox mRNA表达较手术组明显降低，差异有显著性（F=27.13～34.16，P<0.05）。见表2。

2.3各组Atox1、Lox蛋白表达比较

术后14、28 d，手术组Atox1、Lox蛋白表达较对照组明显增高，药物组Atox1、Lox蛋白表达较手术组明显降低，差异有显著性（F=25.73～30.51，P<0.05）。见表2。

3讨论

在CHD的治疗史中，PCI的出现可谓里程碑事件，为CHD的治疗带来革命性的变化，但PCI术后再狭窄却是一个尚未解决的难题。如本文实验所见，血管球囊损伤术后血管内膜及中膜明顯增生。再狭窄机制复杂，包括内皮损伤、血栓形成、VSMC增殖迁移、细胞外基质聚集及炎症因子的激活等，其中VSMC迁移和增殖是PCI术后再狭窄的主要机制[3，1921]。VSMC在生理状态下位于血管中膜，处于细胞周期的静止期，主要通过收缩和舒张调节血管张力。当血管损伤后，VSMC转变表型进入分裂周期，其从中膜迁移至内膜，在内膜分裂增殖，并合成和分泌大量细胞外基质形成新生内膜[22]。

AngⅡ是肾素血管紧张素系统中主要活性肽，其作用广泛，当血管受损时，AngⅡ表达明显增加，其可通过AT1引起VSMC的增殖和迁移，促进血管内膜增生，引起血管再狭窄[2325]。铜是维持机体正常生理功能不可或缺的微量元素之一，铜与心血管疾病关系的研究由来已久[26]。Atox1是一种重要的铜伴侣蛋白，其内含有一个独特的序列——MXCXXC（其中M为甲硫氨酸，X为任意氨基酸，C代表半胱氨酸），能高效紧密地结合铜并将其转移至靶标。Atox1与铜水平可能存在负相关关系[27]，且能够影响铜的分布。研究表明，Atox1参与平滑肌细胞的增殖[12]；进一步研究发现，Atox1参与平滑肌细胞的迁移和血管损伤后的重塑[14]。本文研究结果显示，血管球囊损伤术后Atox1表达增加，提示其可能参与血管损伤术后再狭窄的过程。Lox是铜依赖的赖氨酸氧化酶，只有结合铜的Lox才具有较高的活性，其主要参与催化细胞外基质中胶原和纤维蛋白的赖氨酸残基交联，以维持细胞外基质的结构和功能[28]。进一步研究发现，降低Lox转录可以影响内皮细胞的表达活性，引起血管内皮细胞通透性的增加[2930]。Lox在VSMC增殖方面的作用仍有争议，但其影响VSMC迁移已被肯定。本文研究结果显示，血管球囊损伤后Lox的表达增加，提示其可能与血管球囊损伤术后再狭窄有关。缬沙坦是高选择性ARB，能竞争性抑制AngⅡ的作用，抑制VSMC增殖、迁移，减少内膜损伤后重塑。本文研究结果显示，缬沙坦可减轻损伤后血管内膜的增生，并且应用缬沙坦后Atox1、Lox mRNA和蛋白的表达显著降低，提示缬沙坦抑制血管内膜增生可能与Atox1、Lox的表达变化有关。但本实验只是显示了血管损伤术后Atox1、Lox表达增加的现象，却没有进一步阐明其具体机制。需要进行进一步深入的研究，以明确PCI术后再狭窄的机制及缬沙坦对其作用。

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（本文編辑黄建乡）